醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)：臨床科研課題的設(shè)計(jì)與研究方法

CreativityKnowledgeExperience臨床科研課題的設(shè)計(jì)與研究方法為什么做科研？不是目的，是訓(xùn)練！科學(xué)的思考問題的方式科學(xué)的解決問題的方式科學(xué)的探索問題的方式科學(xué)的精神原始觀察

收集數(shù)據(jù)

解釋結(jié)果

結(jié)論Refertoknowledge

提出假設(shè)

設(shè)計(jì)對照實(shí)驗(yàn)課題設(shè)計(jì)流程：骨質(zhì)疏松肥胖臨床觀察現(xiàn)象證實(shí)相關(guān)性確定因果關(guān)系探討內(nèi)在機(jī)制三件事：證實(shí)相關(guān)性文獻(xiàn)：類似報(bào)道設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)：制定相關(guān)性指標(biāo)：肥胖：骨質(zhì)疏松：BMI，血脂etc骨量測定三板斧該因素是否現(xiàn)象有關(guān)加強(qiáng)該因素的作用，現(xiàn)象是否放大抑制該因素的作用，現(xiàn)象是否消失或減弱生理因素、基因功能確定因果關(guān)系：確定因果關(guān)系病人？動物模型！藥物誘導(dǎo)基因組改造ZhuH,etal.NatureRev.Genet.2011,12:266-275.KnockoutbyHRinESCstargettargetingvectorneorneorhomologousrecombination“knockout”TK

TotipotentembryostemcellHomologousrecombinationTargetedgenomeeditingwithRNA-guidedCas9HwangW,etal.NatBiotechnol.2013,31:227-229.ChoS,etal.NatBiotechnol.2013,31:230-232.JiangW,etal.NatBiotechnol.2013,31:233-239.觀察制定相關(guān)性指標(biāo)：肥胖：骨質(zhì)疏松：BMI，血脂etc骨量測定表型分析：動物模型：引起肥胖

引起骨質(zhì)疏松生化檢測生理數(shù)據(jù)分析組織學(xué)檢測細(xì)胞學(xué)檢測信號通路檢查基因表達(dá)分析鑒定相關(guān)基因需要收集的證據(jù)：生化檢測生理數(shù)據(jù)分析組織學(xué)檢測細(xì)胞學(xué)檢測發(fā)育生物學(xué)分析信號通路檢查基因表達(dá)分析動物模型靶基因？藥物篩選基因治療真核生物具有十分相似的細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制單細(xì)胞的酵母：細(xì)胞分析蛙的早期胚胎：生化分析果蠅：遺傳分析哺乳動物的培養(yǎng)細(xì)胞：細(xì)胞功能分析1，

酵母芽殖酵母SaccharomycesCerevisiae裂殖酵母Schizosaccharomycespombe

芽殖酵母SaccharomycesCerevisiae裂殖酵母Schizosaccharomycespombe特點(diǎn)：快速增殖較小并完全明確的基因組能在單倍體狀態(tài)下進(jìn)行繁殖，染色體以單個(gè)拷貝或同源物在細(xì)胞中存在容易制造突變來失活某個(gè)基因容易刪除特定基因容易用已知突變來取代特定基因酵母中細(xì)胞周期調(diào)控的遺傳分析

2，

黑腹果蠅

Drosophilamelanogaster世代周期為2周，在實(shí)驗(yàn)室控制條件下容易生長。細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)的成分與特征——尤其是多細(xì)胞動物特有的——與人的極為相似。果蠅的基因組含有約14,000個(gè)基因，大概是酵母的兩倍，人細(xì)胞的一半。外源基因也能夠在特定的組織中或在誘導(dǎo)型啟動子的控制下異位表達(dá)。對經(jīng)典遺傳學(xué)來說，用果蠅能很容易地進(jìn)行突變基因的篩選。第一節(jié)

細(xì)胞的形態(tài)觀察形態(tài)觀察是細(xì)胞生物學(xué)最基本的研究方法，其工具主要為顯微鏡

根據(jù)光源的不同，可將顯微鏡分為：

光學(xué)顯微鏡：以可見光（或紫外線）為光源。

電子顯微鏡

：以電子束為光源。一、顯微鏡的光學(xué)原理:Humaneye顯微觀察方式相差觀察方式應(yīng)用：

無色透明活體標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)，檢查,鑒定活體細(xì)胞(培養(yǎng)細(xì)胞,分離細(xì)胞)微分干涉（DIC）觀察方法幾種顯微鏡的效果比較：熒光顯微鏡：

細(xì)胞中的某些物質(zhì)如葉綠素受到紫外光的照射可以發(fā)出熒光，尤其是細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)可以特意地結(jié)合熒光染料后，受到特定波長的光的激發(fā)可以發(fā)出熒光，這樣我們可以對這些物質(zhì)進(jìn)行定性和在細(xì)胞內(nèi)的定位研究

。用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。（五）激光共聚焦顯微鏡：

用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍一、Confocal的原理PMTxy焦平面上的點(diǎn)成像光路

為什么選擇Confocal?Confocal最大限度減少了背景模糊像的干擾PMTxy焦平面以下的點(diǎn)的成像光路Confocal最大限度減少了背景模糊像的干擾為什么選擇Confocal?PMTxy焦平面以上的點(diǎn)的成像光路Confocal最大限度減少了背景模糊像的干擾為什么選擇Confocal?可以對樣品進(jìn)行光切片，進(jìn)行活細(xì)胞的觀察內(nèi)部的結(jié)構(gòu)，在計(jì)算機(jī)輔助下，對樣品進(jìn)行分析。

（六）高分辨率顯微鏡自從1873年ErnstAbbe第一次發(fā)現(xiàn)光學(xué)成像具有衍射限制現(xiàn)象以來，物理學(xué)界就公認(rèn)，顯微鏡的分辨率具有極限，該極限與光源的波長有關(guān)。直到一個(gè)多世紀(jì)之后，羅馬尼亞物理學(xué)家StefanHell推翻了這一觀點(diǎn)。他是首位不僅從理論上論證了，而且用實(shí)驗(yàn)證明了使用光學(xué)顯微鏡能達(dá)到納米級分辨率的科學(xué)家。PALM&FPALM:單分子發(fā)光

Thisapproachreliesonthestochasticactivationoffluorescencetointermittentlyphotoswitchindividualphotoactivatablemoleculestoabrightstate,whicharethenimagedandphotobleached光學(xué)顯微鏡：以可見光（或紫外線）為光源。?

電子顯微鏡：以電子束為光源。二、電子顯微鏡

以電子束作光源，電磁場作透鏡。電子束的波長短，并且波長與加速電壓(通常50~120KV)的平方根成反比。由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達(dá)百萬倍。用于觀察超微結(jié)構(gòu)（ultrastructure），即小于0.2μm、光學(xué)顯微鏡下無法看清的結(jié)構(gòu)，又稱亞顯微結(jié)構(gòu)（submicroscopicstructures）。原理（一）、透射電子顯微鏡Figure3-20.Electronmicrographofaroot-tipcellstainedwithosmiumandotherheavymetalions.Thecellwall,nucleus,vacuoles,mitochondria,endoplasmicreticulum,Golgiapparatus,andribosomesareeasilyseen.Figure3-63.Immunogoldelectronmicroscopy.Electronmicrographsofaninsulin-secretingcellinwhichtheinsulinmoleculeshavebeenlabeledwithanti-insulinantibodiesboundtotinycolloidalgoldspheres.Mostoftheinsulinisstoredinthedensecoresofsecretoryvesicles;inaddition,somecoresarebeingdegradedinlysosomes.（二）掃描電子顯微鏡工作原理：是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級電子由探測器收集，信號經(jīng)放大用來調(diào)制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。透射式電子顯微鏡

掃描電子顯微鏡

細(xì)胞生理學(xué)研究

向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入不同試劑,激活或拮抗細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的活性,觀察對細(xì)胞行為的影響.微試管:功能研究抑制或者增加蛋白質(zhì)的功能：GeneoverexpressionFluorescenceResonance

EnergyTransfer

(FRET)Iftheemissionspectrumofa“donor”moleculeoverlapstheexcitationspectrumofan“acceptor”moleculeThedistancebetweenthesetwomoleculesarewithin10-100A,thedonorandacceptorfluorophoresmustbeinfavorablemutualorientation.熒光共振能量轉(zhuǎn)移GFPproteinjellyfishAequoreavictoria

FRET熒光組合供體分子受體分子激發(fā)光（供體）(nm）熒光(nm)發(fā)射光（供體）發(fā)射光（受體）BFPCFP365460535CFPYFP440480535GFPRhod-2488535595FITCCy3488535595FRETDetectionbyIntensity:FRETdetectionbyacceptorphotobleaching:應(yīng)用1：Ca2+濃度測定-基于生理狀況的測定EGTA