微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用

微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用培養(yǎng)基的種類培養(yǎng)基種類繁多，根據(jù)其成分、物理狀態(tài)和用途可將培養(yǎng)基分成多種類型。(1)按成分不同劃分1)天然培養(yǎng)基(complexmediurn)這類培養(yǎng)基含有化學(xué)成分還不清楚或化學(xué)成分不恒定的天然有機物，也稱非化學(xué)限定培養(yǎng)基(chemicallyundefinedmediunl)。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基就屬于此類?；蚩寺〖夹g(shù)中常用的LB(Luria—Bertani)培養(yǎng)基也是一種天然培養(yǎng)基，其組成見表4—10。常用的天然有機營養(yǎng)物質(zhì)包括牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏(表4—11)、豆芽汁、玉米粉、土壤浸液、麩皮、牛奶、血清、稻草浸汁、羽毛浸汁、胡蘿卜汁、椰子汁等，嗜糞微生物(coprophilousmicroorganisms)可以利用糞水作為營養(yǎng)物質(zhì)。天然培養(yǎng)基成本較低，除在實驗室經(jīng)常使用外，也適于用來進行工業(yè)上大規(guī)模的微生物發(fā)酵生產(chǎn)。2)合成培養(yǎng)基(syntheticmedium)合成培養(yǎng)基是由化學(xué)成分完全了解的物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基，也稱化學(xué)限定培養(yǎng)基(chemicallydefinedmediurn)，高氏I號培養(yǎng)基和查氏培養(yǎng)基就屬于此種類型。配制合成培養(yǎng)基時重復(fù)性強：，但與天然培養(yǎng)基相比其成本較高，微生物在其中生長速度較慢，一般適于在實驗室用來進行有關(guān)微生物營養(yǎng)需求、代謝、分類鑒定、生物量測定、菌種選育及遺傳分析等方面的研究工作。

(2)根據(jù)物理狀態(tài)劃分根據(jù)培養(yǎng)基中凝固劑的有無及含量的多少，可將培養(yǎng)基劃分為固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基三種類型。1)固體培養(yǎng)基(solidmedium)在液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑，使其成為固體狀態(tài)即為固體培養(yǎng)基。理想的凝固劑應(yīng)具備以下條件：①不被所培養(yǎng)的微生物分解利用；②在微生物生長的溫度范圍內(nèi)保持固體狀態(tài)，在培養(yǎng)嗜熱細菌時，由于高溫容易引起培養(yǎng)基液化，通常在培養(yǎng)基中適當(dāng)增加凝固劑來解決這一問題；③凝固劑凝固點溫度不能太低，否則將不利于微生物的生長；④凝固劑對所培養(yǎng)的微生物無毒害作用；⑤凝固劑在滅菌過程中不會被破壞；⑥透明度好，粘著力強；⑦配制方便且價格低廉。常用的凝固劑有瓊脂(agar)、明膠(gdatin)和磚膠(silicagel)。表4—12列出瓊脂和明膠的一些主要特征。對絕大多數(shù)微生物而言，瓊脂是最理想的凝固劑，瓊脂是由藻類(海產(chǎn)石花菜)中提取的一種高度分支的復(fù)雜多糖；明膠是由膠原蛋白制備得到的產(chǎn)物，是最早用來作為凝固劑的物質(zhì)，但由于其凝固點太低，而且某些細菌和許多真菌產(chǎn)生的非特異性胞外蛋白酶以及梭菌產(chǎn)生的特異性膠原酶都能液化明膠，目前已較少作為凝固劑；硅膠是由無機的硅酸鈉(Na2Si03)及硅酸鉀(K2SiO3)被鹽酸及硫酸中和時凝聚而成的膠休，它不含有機物，適合配制分離與培養(yǎng)自養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基。除在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑制備的固體培養(yǎng)基外，一些由天然固體基質(zhì)制成的培養(yǎng)基也屬于固體培養(yǎng)基。例如，由馬鈴薯塊、胡蘿卜條、小米、麩皮及米糠等制成固體狀態(tài)的培養(yǎng)基就屬于此類。又如生產(chǎn)酒的酒曲，生產(chǎn)食用菌的棉子殼培養(yǎng)基。在實驗室中，固體培養(yǎng)基一般是加入平皿或試管中，制成培養(yǎng)微生物的平板或斜面。固體培養(yǎng)基為微生物提供一個營養(yǎng)表面，單個微生物細胞在這個營養(yǎng)表面進行生長繁殖，可以形成單個菌落。固體培養(yǎng)基常用來進行微生物的分離、鑒定、活菌計數(shù)及菌種保藏等。2)半固體培養(yǎng)基(semisolidmedium)半固體培養(yǎng)基中凝固劑的含量比固體培養(yǎng)基少，培養(yǎng)基中瓊脂含量一般為0．2％—0．7％。半固體培養(yǎng)基常用來觀察微生物的運動特征、分類鑒定及噬菌體效價滴定等。3)液體培養(yǎng)基(1iquidmedium)液體培養(yǎng)基中未加任何凝固劑。在用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)微生物時，通過振蕩或攪拌可以增加培養(yǎng)基的通氣量，同時使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)分布均勻。液體培養(yǎng)基常用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)：以及在實驗室進行微生物的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用方面的研究。(3)按用途劃分1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(minimummedium)盡管不同微生物的營養(yǎng)需求各不相同，但大多數(shù)微生物所需的基本營養(yǎng)物質(zhì)是相同的?；A(chǔ)培養(yǎng)基是含有一般微生物生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是最常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基?；A(chǔ)培養(yǎng)基也可以作為一些特殊培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分，再根據(jù)某種微生物的特殊營養(yǎng)需求，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入所需營養(yǎng)物質(zhì)。2)加富培養(yǎng)基(enrichmentmedium)加富培養(yǎng)基也稱營養(yǎng)培養(yǎng)基，即在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某些特殊營養(yǎng)物質(zhì)制成的一類營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，這些特殊營養(yǎng)物質(zhì)包括血液、血清、酵母浸膏、動植物組織液等。加富培養(yǎng)基一般用來培養(yǎng)營養(yǎng)要求比較苛刻的異養(yǎng)型微生物，如培養(yǎng)百日咳博德氏菌(Bordetellapertussis)需要含有血液的加富培養(yǎng)基。加富培養(yǎng)基還可以用來富集和分離某種微生物，這是因為加富培養(yǎng)基含有某種微生物所需的特殊營養(yǎng)物質(zhì)，該種微生物在這種培養(yǎng)基中較其他微生物生長速度快，并逐漸富集而占優(yōu)勢，逐步淘汰其他微生物，從而容易達到分離該種微生物的目的。從某種意義上講，加富培養(yǎng)基類似選擇培養(yǎng)基，兩者區(qū)別在于，加富培養(yǎng)基是用來增加所要分離的微生物的數(shù)量，使其形成生長優(yōu)勢，從而分離到該種微生物；選擇培養(yǎng)基則一般是抑制不需要的微生物的生長，使所需要的微生物增殖，從而達到分離所需微生物的目的。3)鑒別培養(yǎng)基(diffeventialmediL!111)鑒別培養(yǎng)基是用于鑒別不同類型微生物的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中加入某種特殊化學(xué)物質(zhì)，某種微生物在培養(yǎng)基中生長后能產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，而這種代謝產(chǎn)物可以與培養(yǎng)基中的特殊化學(xué)物質(zhì)發(fā)生特定的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征性變化，根據(jù)這種特征性變化，可將該種微生物與其他微生物區(qū)分開來。鑒別培養(yǎng)基主要用于微生物的快速分類鑒定，以及分離和篩選產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物的微生物菌種。常用的一些鑒別培養(yǎng)基參見表4—13。4)選擇培養(yǎng)基(selectivemedium)選擇培養(yǎng)基是用來將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來的培養(yǎng)基。根據(jù)不同種類微生物的特殊營養(yǎng)需求或?qū)δ撤N化學(xué)物質(zhì)的敏感性不同，在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的特殊營養(yǎng)物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)，抑制不需要的微生物的生長，有利于所需微生物的生長。一種類型選擇培養(yǎng)基是依據(jù)某些微生物的特殊營養(yǎng)需求設(shè)計的，例如，利用以纖維素或石蠟油作為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基，可以從混雜的微生物群體中分離出能分解纖維素或石蠟油的微生物；利用以蛋白質(zhì)作為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以分離產(chǎn)胞外蛋白酶的微生物；缺乏氮源的選擇培養(yǎng)基可用來分離固氮微生物。另一類選擇培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，這種化學(xué)物質(zhì)沒有營養(yǎng)作用，對所需分離的微生物無害，但可以抑制或殺死其他微生物，例如，在培養(yǎng)基中加人數(shù)滴10％酚可以抑制細菌和霉菌的生長，從而由混雜的微生物群體中分離出放線菌；在培養(yǎng)墓中加入亞硫酸鉍，可以抑制革蘭氏陽性細菌和絕大多數(shù)革蘭氏陰性細菌的生長，而革蘭氏陰性的傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi）可以在這種培養(yǎng)基上生長；在培養(yǎng)基中加入染料亮綠(brilliantgreen)或結(jié)晶紫(crystalviolet)，可以抑制革蘭氏陽性細菌的生長，從而達到分離革蘭氏陰性細菌的目的；在培養(yǎng)基中加入青霉素、四環(huán)素或鏈霉素，可以抑制細菌和放線菌生長，而將酵母菌和霉菌分離出來?，F(xiàn)代基因克隆技術(shù)中也常用選擇培養(yǎng)基，在篩選含有重組質(zhì)粒的基因工程菌株過程中，利用質(zhì)粒上具有的對某種(些)抗生素的抗性選擇標(biāo)記，在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)抗生素，就能比較方便地淘汰非重組菌株，以減少篩選目標(biāo)菌株的工作量。在實際應(yīng)用中，有時需要配制既有選擇作用又有鑒別作用的培養(yǎng)基。例如，當(dāng)要分離金黃色葡萄球菌時，在培養(yǎng)基中加入7．5％NaCl、甘露糖醇和酸堿指示劑，金黃色葡萄球菌可耐高濃度NaCl，且能利用甘露糖醇產(chǎn)酸。因此，能在上述培養(yǎng)基生長，而且菌落周圍培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化，則該菌落有可能是金黃色葡萄球菌，再通過進一步鑒定加以確定。5)其他除上述四種主要類型外，培養(yǎng)基按用途劃分還有很多種，比如：分析培養(yǎng)基(assaymedium)常用來分析某些化學(xué)物質(zhì)(抗生素、維生素)的濃度，還可用來分析微生物的營養(yǎng)需求；還原性培養(yǎng)基(reducedmedium)專門用來培養(yǎng)厭氧型微生物；組織培養(yǎng)物培養(yǎng)基(tissue-culturemidium)含有動、植物細胞，用來培養(yǎng)病毒、衣原體(chlamydia)、立克次氏體(rickettsia)及某些螺旋體(spirochete)等專性活細胞寄生的微生物。盡管如此，有些病毒和立克次氏體目前還不能利用人工培養(yǎng)基來培養(yǎng)，需要接種在動植物體內(nèi)、動植物組織中才能增殖。常用的培養(yǎng)病毒與立克次氏體的動物有小白鼠、家鼠和豚鼠，雞胚也是培養(yǎng)某些病毒與立克次氏體的良好營養(yǎng)基質(zhì)，雞瘟病毒、牛痘病毒、天花病毒、狂犬病毒等十幾種病毒也可用雞胚培養(yǎng)。

小知識:瓊脂和固體培養(yǎng)基最早用來培養(yǎng)微生物的人工配制的培養(yǎng)基是液體狀態(tài)的，但是，用液體培養(yǎng)基分離并獲得微生物純培養(yǎng)非常困難：將混雜的微生物樣品進行系列稀釋，直到平均每個培養(yǎng)管中只有一個微生物個體，進而獲得微生物純培養(yǎng)物。此方法不僅煩瑣，而且重復(fù)性差，并常導(dǎo)致純培養(yǎng)物被雜菌污染。因此，在早期微生物學(xué)研究中，分離(病原)微生物的進展相當(dāng)緩慢。利用固體培養(yǎng)基分離培養(yǎng)微生物的技術(shù)，首先是由德國細菌學(xué)家RobertKoch及其助手建立的。1881年，Koch發(fā)表論文介紹利用土豆片分離微生物的方法，其作法是：用灼燒滅菌的刀片將煮熟的土豆切成片，然后用針尖挑取微生物樣品在土豆片表面劃線接種，經(jīng)培養(yǎng)后可獲得微生物的純培養(yǎng)。上述方法的缺點是一些細菌在土豆培養(yǎng)基上生長狀態(tài)較差。幾乎在同時，Koch的助手PrederickLoeffier發(fā)展了利用肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)病原細菌的方法，Koch決定采取方法固化此培養(yǎng)基。值得提及的是，Koch還是一個業(yè)余攝影家，是他首先拍出細菌的顯微照片，具有利用銀鹽和明膠制備膠片的豐富經(jīng)驗。作為一名知識淵博的杰出科學(xué)家，Koch將其制備膠片方面的知識應(yīng)用到微生物學(xué)研究方面，他將明膠和肉膏蛋白胨培養(yǎng)基混合后鋪在玻璃平板上，讓其凝固，然后采取在土豆片表面劃線接種的同樣方法在其表面接種微生物，獲得純培養(yǎng)。但由于明膠溶點低，而且容易被一些微生物分解利用，其使用受到限制。有意思的是，Koch一名助手的妻子FannieEilshemiusHesse，具有豐富的廚房經(jīng)驗，當(dāng)她聽說明膠作為凝固劑遇到的問題后，提議以廚房中用來做果胨的瓊脂代替明膠。1882年，瓊脂就開始作為凝固劑用于固體培養(yǎng)基的配制，這樣，瓊脂從餐桌走向了實驗臺，為微生物學(xué)發(fā)展起到重要作用，一百多年來，一直延用至今，是培養(yǎng)基最好的凝固劑。植物有效成分的提取加入碎瓷片為什么能夠防止暴沸？

純凈的液體缺少汽化核心，加熱超過沸點仍不沸騰的熱滯后現(xiàn)象——加一點雜質(zhì)后（本質(zhì)是帶入了微小氣泡），沸騰滯后被打破，產(chǎn)生沸騰。液體中的氣泡在沸騰過程中起著汽化核的作用，當(dāng)液體中缺少氣泡時，即使溫度達到并超過了沸點，也不會沸騰，形成了過熱液體。過熱液體是不穩(wěn)定的，如果過熱液體的外部環(huán)境溫度突然急劇下降或侵入氣泡，則會形成劇烈的沸騰，并伴有爆裂聲，這種現(xiàn)象叫暴沸．暴沸的結(jié)果是使液體的溫度回到沸點．暴沸有時是危險的。

在液體中加入碎瓷片的原理與加入雜質(zhì)相同，主要是通過孔隙凝聚水蒸汽，使成為氣泡浮出，防止爆沸。

沸騰的時候就是因為實驗器皿的底部溫度很高，接觸它的水（液體）馬上蒸發(fā)變?yōu)樗魵?，?/p>