草莓莖尖培養(yǎng)及脫毒研究

草莓莖尖培養(yǎng)及脫毒研究

草莓是薔薇科的一種多年生草本植物。這是一種漿果。在世界范圍內(nèi)，食用漿果的栽培面積和產(chǎn)量低于葡萄糖，是世界水果。草莓是靠匍匐莖進(jìn)行無性繁殖的作物,由于種植年限較長,加上連作、以結(jié)果母株繁苗等,體內(nèi)病毒積累逐年增加,病毒病發(fā)生嚴(yán)重。感染了病毒的草莓生長緩慢、葉皺縮、果子一年比一年小、畸形、品質(zhì)差,一般減產(chǎn)30%～80%,并逐年加重。在我國已造成損失的草莓病毒病主要有草莓斑駁病毒(SmoV),草莓輕型黃邊病毒(SMYEV),草莓鑲脈病毒(SVBV),草莓皺縮病毒(SCrV)等四種。王國平報(bào)道這四種病毒總侵染率為80.2%,其中單種病毒侵染率為41.6%,2種以上的病毒復(fù)合侵染率為38.6%。時(shí)至今日,病毒病已成為草莓主要病害之一,嚴(yán)重阻礙了草莓產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。對于病毒病,目前還沒有藥劑可以治理。因此,培育無病毒母本苗,栽培無病毒苗木,是防治草莓病毒病的根本對策。目前,世界上培育草莓無毒苗有3種方法:熱治療法、花藥培養(yǎng)法和莖尖培養(yǎng)法。用莖尖培養(yǎng)法進(jìn)行無病毒苗的培育,是目前世界上獲得草莓無毒苗最普通且最有效的方法。1962年BelkengrenandMiller首先用組織培養(yǎng)的方法獲得了草莓無病毒苗。草莓無病毒苗具有明顯的恢復(fù)植株長勢和增產(chǎn)的效果。我國自鄧明琴(1981)通過草莓莖尖獲得了無病毒植株以來,也一直在從事這方面的研究,并逐步提出了一些改進(jìn)措施。童堯明等以草莓莖尖分生組織(0.2mm～0.4mm(毫米))一次性培養(yǎng)出組培苗,出苗率為83%～90%,脫毒率達(dá)100%。覃蘭英等(1988)將草莓苗在35℃下熱處理7d(天)后,逐步升溫至38℃獲得100%的脫毒苗。高山林把切取的草莓芽洗凈后經(jīng)過高溫短時(shí)間熱處理,然后用莖尖培養(yǎng)法獲得無病毒草莓苗。高遐虹等用二次脫毒法獲得無病毒草莓苗。但是一次性脫毒培養(yǎng)剝?nèi)〉那o尖小,技術(shù)要求太高。傳統(tǒng)熱處理法由于較長時(shí)間的高溫高濕,很容易感染紅蜘蛛一類昆蟲危害,且熱處理后的材料在接種組培時(shí),表面消毒不易徹底。改良熱處理的溫度及操作過程未見有報(bào)道。而且,近年來,用莖尖培養(yǎng)對草莓脫病毒的研究報(bào)道很多,但是,在電鏡及小葉嫁接法對脫病毒檢測方面上的報(bào)道很少見。本實(shí)驗(yàn)針對以上三個(gè)方面的問題進(jìn)行探索,對草莓莖尖脫毒培養(yǎng)進(jìn)行研究,并結(jié)合熱處理,冷處理和二次脫毒等方法,為提高草莓莖尖脫毒培養(yǎng)尋找更適合的途徑和方法。1材料和方法1.1m4cm納米長的頂長本實(shí)驗(yàn)以草莓匍匐莖為材料,截取3cm～4cm(厘米)長的頂端。品種為豐香,由青浦趙屯草莓資源圃提供,其中二次脫毒法所用的材料是一次脫毒的試管苗。1.2幼葉的誘導(dǎo)生根自田間選取健壯草莓母株上生長充實(shí)而小葉尚為展開的匍匐莖頂端約3cm～4cm(厘米)長的頂芽,用自來水沖洗2h～3h(小時(shí))后,在超凈臺(tái)上進(jìn)行常規(guī)滅菌處理。在雙筒解剖鏡下由外向內(nèi)逐層剝?nèi)ビ兹~,切取0.5mm(毫米)左右大小莖尖接種于MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng),將分化出的小苗在1/2MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。注:所有培養(yǎng)基均含有3%蔗糖,0.8%瓊脂,pH=5.6。1.2.1干燥劑的脫毒法1.2.1.莖尖生長點(diǎn)接種與培養(yǎng)在超凈工作臺(tái)上,分別以0.2mm、0.5mm、1.0mm(毫米)大小切取莖尖生長點(diǎn)接種于最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,移至培養(yǎng)室培養(yǎng)。1.2.1.葉原基、長度對培養(yǎng)莖尖的影響改良莖尖培養(yǎng)脫毒法,即二次脫毒培養(yǎng)法。先在解剖鏡下切取帶3～4個(gè)葉原基、長度為0.5mm(毫米)的莖尖生長點(diǎn),進(jìn)行培養(yǎng),兩個(gè)月后,當(dāng)試管苗長到1cm～2cm(厘米)時(shí),從中選取試管苗,再次切取0.5mm(毫米)的莖尖進(jìn)行二次脫毒培養(yǎng)。1.2.1.莖尖的剝除改良熱處理+莖尖培養(yǎng)法,是將草莓匍匐莖洗凈后,35℃～50℃水浴處理4h(小時(shí)),再在無菌條件下剝?nèi)∏o尖,切取0.5mm(毫米)大小進(jìn)行培養(yǎng)。1.2.1.苗苗的培養(yǎng)自田間采取3cm～5cm高的草莓苗,栽在小花盆里,于10℃的低溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2個(gè)月,選健壯植株剝?nèi)?.5mm(毫米)莖尖進(jìn)行培養(yǎng)。1.2.2集體培訓(xùn)苗族遠(yuǎn)離毒效果的確定1.2.2.指示植物的選擇草莓的病毒像其它多年生作物的病毒一樣,很難像一年生草本植物那樣,用汁液接種法進(jìn)行鑒定?，F(xiàn)在通常采用野生種草莓,按Bringhurst的小葉嫁接法來進(jìn)行鑒定。本實(shí)驗(yàn)所用的指示植物為UC10,其對草莓卷葉病毒有很好的檢測能力。首先是從被鑒定的草莓采集長成不久的新葉,除去兩邊的小葉,中央的小葉帶1cm～1.5cm(厘米)長的葉柄,把它削成鍥形作接穗;而指示植物除去中間的小葉,在葉柄的中央部切入1cm～1.5cm(厘米)再插入準(zhǔn)備好的接穗,用細(xì)線扎好,涂上少量的白色凡士林以防干燥。每顆野生草莓做兩片葉子。嫁接后兩周為保持成活,罩上塑料薄膜袋。40d(天)后調(diào)查野生草莓卷葉病毒病發(fā)生情況。1.2.2.速度快,速度快用電子顯微鏡鑒定比小葉嫁接的指示植物鑒定法直觀,且速度快。主要方法是用負(fù)染法處理被測葉片,然后分別在15000、20000、30000倍下觀察,即可以清楚地看到細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中是否有病毒粒子。2結(jié)果與分析2.1帶卷葉病毒檢測直接從豐香草莓匍匐莖上分別剝?nèi)?.2mm、0.5mm、1.0mm(毫米)大小的莖尖進(jìn)行培養(yǎng),結(jié)果如表1所示。從表1可以看到草莓莖尖成活率受莖尖大小影響非常大。在相同培養(yǎng)基上,草莓莖尖越小,莖尖的成活率越低,反之,剝?nèi)〉那o尖越大,莖尖的成活率越高。在最優(yōu)培養(yǎng)基MS+BA0.5mg/L(毫米/升)上。大小為0.2mm(毫米)的莖尖成活率為16.67%,大小為0.5mm(毫米)的莖尖成活率為66.67%,大小為1.0mm(豪米)的莖尖成活率為83.33%,可見,剝?nèi)〉那o尖大小直接影響著草莓在培養(yǎng)基中的成活率。從表1還可以看出,以UC10野生草莓檢測各試管苗帶卷葉病毒情況,0.2mm(毫米)大小莖尖獲得的草莓試管苗經(jīng)嫁接后,指示植物沒有皺縮現(xiàn)象發(fā)生(圖2-a)。而0.5mm(毫米)、1.0mm(毫米)大小莖尖的試管苗嫁接到UC10上后,UC10表現(xiàn)出不同程度的皺縮,與1.0mm(毫米)大小莖尖的試管苗相比,0.5mm(毫米)的要好得多(圖2-c、d)。從電鏡檢測結(jié)果來看,0.2大小莖尖得到的試管苗沒有檢測到病毒,0.5大小莖尖得到的試管苗經(jīng)電鏡檢測每個(gè)視野可觀察到2個(gè)桿狀病毒(圖1-a),而1.0大小莖尖得到的試管苗中,每個(gè)視野可觀察到7個(gè)桿狀病毒和少量球狀病毒(圖1-c)?？梢?莖尖大小為0.2mm(毫米)的脫毒效果最好,0.5mm(毫米)次之,但綜合莖尖成活率而言,以0.5mm(毫米)莖尖大小為最理想。2.2高溫處理對設(shè)置試苗的處理效果從表2可以看出一定范圍內(nèi),隨著處理溫度的升高,剝?nèi)〔葺o尖的成活率隨之下降。在35℃時(shí),剝?nèi)〉那o尖成活率為57.14%,與對照(不經(jīng)過高溫處理)的成活率62.50%,相差不大。當(dāng)溫度升到40℃時(shí),成活率降至47.37%,45℃以上草莓莖尖不能成活。經(jīng)不同溫度處理得到的試管苗用UC10野生草莓嫁接,發(fā)現(xiàn)用35℃處理得到的試管苗在野生草莓上的嫁接表現(xiàn)與未經(jīng)高溫處理的表現(xiàn)一致,都使野生草莓新生葉表現(xiàn)輕微皺縮(圖2-d),而經(jīng)40℃和42℃高溫處理的匍匐莖剝?nèi)∏o尖得到的試管苗經(jīng)嫁接后,都表現(xiàn)出無皺縮。同樣電鏡檢測的結(jié)果也是如此,35℃處理和對照可用電鏡檢測到每視野2個(gè)桿狀病毒(圖1-a),40℃和42℃處理檢測不到病毒?？梢娊?jīng)40℃～42℃高溫處理匍匐莖后再剝?nèi)∏o尖,得到的試管苗能達(dá)到100%脫毒率。但綜合成活率考慮,只需用40℃處理就可以了。2.3再生苗中主要病毒類型為了建立更好的脫毒體系,采用幾種方法進(jìn)行比較:直接莖尖脫毒、二次莖尖脫毒、改良熱處理結(jié)合莖尖脫毒、冷處理結(jié)合莖尖脫毒。表3可以看出,4種莖尖脫毒方法中,直接莖尖脫毒法的成活率最高,為66.67%;其次為改良熱處理結(jié)合莖尖脫毒法,為47.37%;然后是冷處理的莖尖脫毒法,成活率為44.44%;最低的是二次莖尖脫毒法,成活率只有26.67%。根據(jù)表3結(jié)果,以UC10野生草莓檢測各試管苗帶卷葉病毒情況,直接剝?nèi)∏o尖大小為0.5mm(毫米)獲得的試管苗以UC10野生草莓嫁接檢測發(fā)現(xiàn)有輕微皺縮(圖2-d),以電鏡檢測發(fā)現(xiàn),每個(gè)視野中可以觀察到2個(gè)桿狀病毒(圖1-a)。改良熱處理、二次脫毒及冷處理的脫毒方法處理的草莓試管苗經(jīng)嫁接后,野生草莓上都沒有皺縮現(xiàn)象發(fā)生,電鏡檢測也觀察不到病毒粒子。而對照(直接田間繁殖)的草莓苗用野生草莓嫁接,新生葉表現(xiàn)出嚴(yán)重皺縮,電鏡檢測發(fā)現(xiàn)每個(gè)視野中可觀察到多達(dá)16個(gè)病毒(圖1-d、e)。其中除了桿狀病毒外,還觀察到了球型病毒?？梢娡ㄟ^莖尖培養(yǎng)的方法來繁殖種苗能有效的去除草莓體內(nèi)所帶的病毒,且三種改良的草莓莖尖脫毒方法都要比直接剝?nèi)∏o尖的方法更有效,脫毒率達(dá)到100%。其中以40℃處理的改良熱處理+莖尖培養(yǎng)法的成活率最高,可達(dá)到47.37%。3討論3.1安全性苗的繁殖在脫毒苗的繁殖過程中,最重要的是防止再次感染。首先是脫毒苗在馴化過程中,所用基質(zhì)必須用蒸汽或用藥劑消毒,以防治土壤病菌和線蟲。其次是防止病毒介體——葉蟬和蚜蟲傳毒,對原種苗僅僅噴藥防治是不夠的,需用0.4mm～0.5mm(毫米)大小的防蟲網(wǎng)進(jìn)行隔離。二級(jí)種苗必須選擇草莓原種苗作母株,在隔離條件下的專用苗圃內(nèi)進(jìn)行繁殖,苗圃和周圍草莓園隔離至少2km(公里),苗圃的土壤要經(jīng)過氯化苦農(nóng)藥消毒。避免在栽過草莓的土地重茬繁殖無毒苗,并注意定期防治蚜蟲。無病毒原種苗可供繁殖3年。無病毒草莓苗的繁殖主要采用匍匐繁殖法。該法具有分生量大、速度快、苗質(zhì)量好等特點(diǎn)。無毒苗繁殖分三個(gè)圃:原原種圃、原種圃、生產(chǎn)圃。原原種生產(chǎn)原種,原種生產(chǎn)生產(chǎn)種。這一過程不僅可以大量繁殖生產(chǎn)用苗,還可以及時(shí)進(jìn)行脫毒效果和變異的鑒定。在防蟲網(wǎng)室中對原原種苗進(jìn)行編號(hào)定植,在其后代苗——原種圃中分別進(jìn)行匍匐莖扦插繁殖,仍然按原原種苗的母株進(jìn)行編號(hào),然后在生產(chǎn)圃中對編號(hào)的原種苗進(jìn)行生產(chǎn)試種,這樣可以直接地鑒定其脫毒效果和變異。一旦發(fā)現(xiàn)在生產(chǎn)上表現(xiàn)不良,就可按編號(hào)全部清除其原原種、原種母株及后代,停止繁殖生產(chǎn)用苗,這樣就可以保證生產(chǎn)用苗為無變異的脫毒健壯苗。為長遠(yuǎn)利益打算,嚴(yán)格隔離的防蟲網(wǎng)室必須建立。研究機(jī)構(gòu)應(yīng)主動(dòng)與生產(chǎn)單位聯(lián)系,指導(dǎo)其建立防蟲網(wǎng)室,并培訓(xùn)技術(shù)人員在防蟲網(wǎng)室中的種苗生產(chǎn)流程。唯有這樣,才能將草莓脫毒健壯苗推向廣大種植戶。3.2再生方法較污的原因在于,立本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,莖尖培養(yǎng)過程中,剝?nèi)∏o尖,開始培養(yǎng),3d～7d(天)陸續(xù)轉(zhuǎn)綠、膨大;14d～28d(天)后形成黃綠色愈傷組織;42d～49d(天)后增殖完成,40d(天)左右繼代一次,生根要20d(天)左右,移栽到大田,4個(gè)月后開花結(jié)果。與鄧群仙、洪燕萍等報(bào)道的一致。高遐紅等認(rèn)為改良的莖尖剝離方法(二次脫毒法)比傳統(tǒng)莖尖剝離法的分化率高,污染率要低。本實(shí)驗(yàn)研究表明,結(jié)果恰好相反,改良的莖尖剝離法比傳統(tǒng)莖尖剝離法的分化率低、污染率高。其原因估計(jì)是因?yàn)樵嚬苊绫忍镩g苗嫩、水分含量多,且試管苗長度太短,切取莖尖時(shí),操作比較困難,又由于操作過程中,手的消毒很難徹底,所以很容易引起污染。直接莖尖剝?nèi)》?剝?nèi)∏o尖0.1mm～0.2mm(毫米)時(shí),脫毒率可達(dá)100%。但是技術(shù)要求高、不易掌握、費(fèi)時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)所用的改良莖尖培養(yǎng)法剝?nèi)〉那o尖都為0.5mm(毫米)大小,獲得的試管苗經(jīng)電鏡及小葉嫁接法鑒定表明,脫毒率都達(dá)100%。但是冷處理+莖尖培養(yǎng)法中,冷處理所需的時(shí)間長,而且需將整株植株放到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2個(gè)月,成本高,