CD4 T淋巴細胞絕對計數(shù)檢測

粒細胞分類淋巴細胞為CD45強陽性，顆粒度較低的一群細胞1淋巴細胞分群B淋巴細胞CD19+T淋巴細胞CD3+T輔助/誘導(dǎo)細胞CD3+CD4+淋巴細胞（CD45+）NK細胞CD3-CD16+56+T抑制/細胞毒性細胞CD3+CD8+2淋巴細胞在免疫應(yīng)答中起核心作用。CD4+T淋巴細胞對細胞免疫和體液免疫平衡的維持具有樞紐的功能。CD4+T淋巴細胞是HIV感染最主要的靶細胞。3HIV及其包膜蛋白的直接細胞致病作用感染細胞-未感染細胞形成合胞體程序性細胞死亡自身免疫機制特異性細胞毒T細胞對HIV感染細胞的破壞作用HIV通過多種直接和間接的病理機制導(dǎo)致CD4+T細胞數(shù)量的缺失，最終引起感染者免疫功能缺陷。

4HIV感染后CD4+、CD8+T細胞變化CD4+T細胞（Th細胞）絕對計數(shù)持續(xù)減少CD8+T細胞（Ts細胞）增高，到疾病晚期時下降T細胞亞群比例倒置，CD4+細胞功能受損51、了解機體的免疫狀態(tài)以進行疾病分期；2、預(yù)測疾病進展，判斷并發(fā)癥的出現(xiàn)；3、確定開始HAART的指征；4、藥物療效的評價指標(biāo)；大多數(shù)病毒完全抑制者，CD4計數(shù)平均每年增加100個/mm3。CD4+T淋巴細胞數(shù)量檢測的意義62-6weeksmeanof10yearsAsymptomaticphaseFlu-likeDiseaseSymptom-aticphaseAIDS10005002000CD4Tcells/mlInfectionSeroconversionDeathCD4TcelldepletionHAART7CD4+T細胞臨床階段A無癥狀或急性HIV感染或持續(xù)性全身淋巴結(jié)腫大B出現(xiàn)癥狀，不是A或CC艾滋病指針性癥狀>500/ul（≥29%）A1B1C1200-499/ul（14-28%）A2B2C2<200/ul（<14%）A3B3C3

成人及青少年艾滋病分期標(biāo)準(zhǔn)（CDC，美國，1993年）

CD4<200/ul和/或出現(xiàn)艾滋病指針性癥狀（如卡氏肺囊蟲肺炎等）時，就可定義為進入艾滋病期。如表中A3，B3，C1-3期。8

并發(fā)癥與CD4細胞數(shù)的關(guān)系（ArchInternMed,1995,155）

CD4細胞數(shù)感染性并發(fā)癥非感染性并發(fā)癥

500/mm3急性逆轉(zhuǎn)錄病毒綜合征持續(xù)性全身淋病腺病

念珠菌性陰道炎吉蘭-巴雷綜合征肌病

無菌性腦膜炎

200~500/mm3肺炎球菌和其它細菌性肺炎子宮頸上皮肉瘤宮頸癌

肺結(jié)核帶狀皰疹鵝口瘡特異性B細胞淋巴瘤

隱孢子蟲病貧血多發(fā)性單神經(jīng)炎

卡波濟肉瘤口腔毛壯白斑病特發(fā)性血小板減少性紫癜

何奇金淋巴瘤淋巴細胞間質(zhì)肺炎

200/mm3卡氏肺孢子蟲肺炎消瘦周圍神經(jīng)紊亂HIV相關(guān)癡呆

組織孢漿菌病球孢子菌病心肌病空泡性脊髓炎

粟粒性/肺外結(jié)核進行性多發(fā)性神經(jīng)根病

多發(fā)性多灶性腦白質(zhì)病何奇金淋巴瘤

100/mm3彌漫性單純皰疹弓形體病

隱球菌病慢性陰孢子蟲病

微孢子蟲病念珠菌食道炎

50/mm3彌漫性巨細胞病毒感染中樞神經(jīng)淋巴瘤

鳥分枝桿菌綜合征

9確定抗HIV藥物治療開展的時機及進行療效評價《艾滋病診斷與治療指導(dǎo)方案》（試行，2002年）

病程CD4+T淋巴細胞病毒載量建議癥狀期任何值任何值治療無癥狀期CD4+T細胞<200/mm3任何值治療無癥狀期CD4+T細胞>200/mm3，但<350/mm3>30000（bDNA）或>55000(RT-PCR)建議治療。另外還要根據(jù)CD4+T細胞下降率和患者的愿望無癥狀期CD4+T細胞>350/mm3<30000（bDNA）或<55000(RT-PCR)建議延遲治療觀察。未經(jīng)治療者3年發(fā)展至AIDS<15%.10雖然CD4+T細胞計數(shù)是監(jiān)測HIV病程的評價工具，但是單獨的CD4+T細胞數(shù)減少不是HIV感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)。其它的免疫缺陷狀況也可以有輔助性T-淋巴細胞數(shù)量減少的結(jié)果:

-丙球蛋白缺乏癥

-胸腺發(fā)育不全(DiGeorge氏綜合癥)

-嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷提示11生理狀況和疾病對CD4+細胞

計數(shù)的影響?晝間變化：最低值是中午12：00左右，最高值是晚上8：30左右，還有季節(jié)變化?急性感染和免疫接種：CD4+細胞計數(shù)減少?藥物：腎上腺皮質(zhì)激素使CD4+細胞計數(shù)↓?性別、成人的年齡、妊娠、心理壓力等對CD4+細胞計數(shù)影響很小?避免在并發(fā)感染治療后或免疫接種后4周內(nèi)檢測12結(jié)果解釋?至少連續(xù)2次CD4+細胞檢測均顯著變化時，才能說明CD4+確實發(fā)生了變化。?

CD4+細胞絕對數(shù)改變30%以上，或CD4+細胞百分比改變>3個百分點才有意義。?例如：CD4+細胞數(shù)為500/μl、CD4+細胞百分比為20%的病人，連續(xù)兩次CD4+細胞計數(shù)下降，絕對數(shù)減少至340/μl，百分比降低為16%，說明CD4+細胞確實發(fā)生了顯著性變化13儀器的選擇1、中央級、省級、研究所、高校、醫(yī)院：流式細胞儀（FACSCalibur、Coulter)2、地區(qū)級及示范區(qū)：專門的流式細胞計數(shù)儀（FACSCount、Guava)3、現(xiàn)場及鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院：（手工方法：如Dynabeads）4、除此之外，在不具備CD4檢測的實驗室，WHO建議用總淋巴細胞來代替。（當(dāng)總淋巴細胞小于1000/ul時，強烈預(yù)示CD4細胞小于200/ul。14流式細胞儀工作原理15流式細胞儀就是進行流式細胞分析的儀器，它集電子技術(shù)、計算機技術(shù)、激光技術(shù)、流體理論于一體，是一種非常先進的檢測儀器。16流式細胞儀的特點單個細胞分析同時多參數(shù)分析速度快：10000個細胞/秒統(tǒng)計學(xué)意義：提供細胞群體的均值和分布情況分選感興趣的細胞17流式細胞術(shù)（FlowCytometry,簡稱FCM,又名FACS）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且同時檢測單個微粒（通常是細胞）的多項特性的技術(shù)，同時可以對特定群體加以分選研究對象為生物顆粒，如各種細胞、染色體、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量工作原理18流式細胞儀儀器結(jié)構(gòu)液流系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng) 激光光源 光收集系統(tǒng)電子系統(tǒng) 光電轉(zhuǎn)換 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)19InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid流式細胞儀流動室示意圖20細胞被戴上特殊的標(biāo)記。所用的標(biāo)記細胞的探針是能夠同待分選細胞表面特征性蛋白(抗原)結(jié)合的抗體，而這種抗體又能夠同某種熒光染料結(jié)合。被結(jié)合的細胞帶上了熒光標(biāo)記。當(dāng)稀釋的細胞進入超聲波振蕩器時，極稀的細胞懸浮液形成很小的液滴，一個液滴中只含有一個細胞。液滴一旦形成并通過激光束時，激光束激發(fā)結(jié)合在細胞表面抗體分子。21FACSCaliburTM系統(tǒng)選配BDBTritest/TruCOUNTTM

試管22樣本的采集、處理

EDTA（血液）抗凝血采血后立即握住試管兩端，顛倒混勻數(shù)次，將血液與抗凝劑混勻，以防止凝固。收集樣品應(yīng)在30h以內(nèi)，盡早（8h以內(nèi)）處理。23樣本的運送在室溫下（18

23℃）保存和運輸樣品，避免極端溫度（冷凍或過熱）。超過37℃的溫度會破壞細胞，對血液學(xué)和流式細胞儀的檢測有影響。不可檢測溶血或結(jié)冰的樣品。不可檢測凝血的樣品。如果樣品的采集時間已超出48h，不可檢測。24試劑BD公司CD3/4/8聯(lián)合抗體BD公司TruCount管25操作步驟20ul抗體50ul全血混勻，避光靜置15分鐘混勻，避光15分鐘450μLFACS溶血液(1x)26應(yīng)用軟件MultiSETFACS系列流式細胞分析儀使用的全自動軟件外周血直接多色熒光分析自動獲取標(biāo)本，分析數(shù)據(jù)獲得關(guān)于外周血中淋巴細胞各類亞型細胞的信息絕對計數(shù)，直接給出結(jié)果。TruCOUNT27檢測外周血，計算淋巴細胞及待測亞型的相對含量和絕對含量使用直接熒光標(biāo)記抗體，一步完成三色或四色熒光標(biāo)記免洗試劑設(shè)計，操作簡便，減少細胞丟失質(zhì)量控制保證28CD4絕對計數(shù)結(jié)果樣本編號名稱檢測結(jié)果散點圖實驗室報告29正常參考值測定結(jié)果臨床報告30MultiSET注意事項使用精密加樣器，準(zhǔn)確加取50

l標(biāo)本，建議使用反向加樣法TruCOUNT管批號不同，beads含量不同，更換批號時注意更改MultiSET中的LotId和beadscount。不同批號的TruCOUNT管不能混用TruCOUNT管應(yīng)在2-25

C密封干燥保存，取出后應(yīng)在1小時內(nèi)使用請配套使用FACS溶血液應(yīng)使用新鮮標(biāo)本進行試驗31內(nèi)置微處理器實現(xiàn)數(shù)據(jù)自動分析自動打印質(zhì)控與病人的檢測結(jié)果簡單易用的系統(tǒng)控制面板配套的樣本制備工作臺簡捷的樣本制備方法，避免細胞損失BDBFACSCountTM系統(tǒng)32儀器特點樣本穩(wěn)定性制備后室溫(20—250C)儲存48小時全血穩(wěn)定性采集后室溫(20—250C)儲存48小時范圍CD4+:50-2000個細胞/uLCD8+:100-2000個細胞/uLCD3+:100-3500個細胞/uL33CD4+T細胞檢測的質(zhì)量控制質(zhì)量控制是指在每一次實驗過程中為確保實驗工作正常進行而必須采取的各種措施。34實驗室質(zhì)量保證工