生物技術在轉基因育種中的應用

生物技術在轉基因育種中的應用

推廣低莖育種和混合水稻技術的應用，提高了我國糧食產(chǎn)量的27.6%。然而近10多年徘徊不前的糧食單產(chǎn)表明,傳統(tǒng)的育種技術已難以承載我國未來糧食安全面臨的巨大挑戰(zhàn)。我國人口的不斷增長和人民生活質量的不斷提高、可用耕地和水資源的日益緊缺、生物及自然災害的頻繁發(fā)生、生態(tài)環(huán)境壓力的持續(xù)加大以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)勞動力數(shù)量的急劇下降等國情都時時警醒我們,中國已進入更加依靠科技創(chuàng)新以保障糧食供給、促進現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的歷史新階段。誕生于20世紀80年代的轉基因技術經(jīng)過短短30年的發(fā)展,已成為新的科技革命的主體之一,相關研究的進展和突破也大大加速了農(nóng)作物更新?lián)Q代的速度及種植業(yè)結構的變革,轉基因技術因此也被認為是繼工業(yè)革命、計算機革命后的第3次技術革命(Abelson,1998),正推動生物經(jīng)濟的形成:一個基因一個產(chǎn)業(yè),一項技術一項產(chǎn)業(yè)。正因為如此,美國、德國、瑞士等發(fā)達國家以及大型跨國公司如孟山都(Monsanto)、杜邦-先鋒(DuPontPioneer)、先正達(Syngenta)、拜耳(Bayer)及巴斯夫(BASF)等投巨資開展新基因的挖掘、轉基因技術研發(fā)以及水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、大豆(Glycinemax)等基因組學研究,目的就是取得并控制基因及相關技術的知識產(chǎn)權。一些發(fā)展中國家更是抓住生物技術發(fā)展的良好機遇大力發(fā)展轉基因育種產(chǎn)業(yè)。因而,農(nóng)業(yè)生物技術已成為國際科技競爭乃至經(jīng)濟競爭的重點,同時也被認為是發(fā)展中國家趕超世界科技前沿難得的突破口。1其他國家抗蟲基因作物種植情況轉基因技術是通過將人工分離和修飾過的基因導入生物體基因組中,借助導入基因的表達,引起生物體性狀可遺傳變化的一項技術。1983年,幾個實驗室?guī)缀跬瑫r通過農(nóng)桿菌方法成功獲得轉外源基因植物(Bevanetal.,1983;Fraleyetal.,1983;HerreraEstrellaetal.,1983;Muraietal.,1983)。到1987年,短短4年時間,第1例抗蟲轉基因番茄(Solanumlycopersicum)就在美國進行了田間實驗。1994年美國農(nóng)業(yè)部(USDA)和美國食品與藥品管理局(FDA)批準了第1例轉基因作物——延熟保鮮轉基因番茄進入市場。1996年,全球轉基因作物種植面積達到160萬公頃。在隨后的十幾年中,轉基因技術的應用得到了迅速發(fā)展,已成為近代育種史上發(fā)展最快、效率最高的作物改良技術。2011年,全球轉基因作物種植面積已超過1.6億公頃,比1996年增加94倍,16年累積種植面積為12.5億公頃。按種植面積計算,全球75%的大豆、82%的棉花(Gossypiumhirsutum)、32%的玉米以及26%的油菜(Brassicanapus)是轉基因品種。耐除草劑性狀是轉基因作物的主要性狀。2011年,耐除草劑大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜(Betavulgaris)以及苜蓿(Medicagosativa)的種植面積達9390萬公頃,占全球轉基因作物種植面積的59%,具抗蟲性狀的轉基因作物種植面積為2390萬公頃,占總種植面積的15%。聚合2種或3種性狀的轉基因作物種植面積為4220萬公頃(James,2011)。截至2011年,全世界已有29個國家進行了轉基因作物商業(yè)化生產(chǎn),10個為發(fā)達國家,19個為發(fā)展中國家。其中9個國家的種植面積超過200萬公頃,發(fā)展中國家種植的轉基因作物占全球轉基因作物的49.9%(James,2011)。預計2012年,發(fā)展中國家的轉基因作物種植面積將超過發(fā)達國家。美國依然是世界上最大的轉基因作物種植國家,2011年其轉基因作物種植面積達6900萬公頃,約占全球轉基因種植總面積的43%。轉基因作物涵蓋大豆、玉米、棉花、油菜、南瓜(Cucurbitamoschata)、番木瓜(Caricapapaya)、苜蓿和甜菜。2011年一個引人注目的事件是,在轉基因植物的發(fā)源地歐洲,西班牙、葡萄牙、捷克、波蘭、斯洛伐克和羅馬尼亞這6個歐盟國家種植了創(chuàng)紀錄的11.45萬公頃的Bt抗蟲轉基因玉米,比2010年增加了26%,并且瑞典和德國也小規(guī)模種植了含新型淀粉組成的轉基因馬鈴薯“AMFlora”。同時,日本也批準了美國抗病毒番木瓜用于新鮮水果/食物消費。2011年,澳大利亞棉花種植面積達到了有史以來的最大值,其中99.5%為轉基因棉,轉基因棉的95%為抗蟲和耐除草劑復合性狀品種。此外,澳大利亞還種植了約14萬公頃的耐除草劑油菜(James,2011)。在發(fā)展中國家,作為“金磚四國”之一的巴西,2003年才開始推動轉基因作物發(fā)展。巴西以政府為主導,抓住生物技術發(fā)展和國際農(nóng)產(chǎn)品價格上漲的機遇,大力推進轉基因作物產(chǎn)業(yè)化。2007年巴西頒布支持轉基因作物產(chǎn)業(yè)化法案,并投資達70億美元(其中60%來自政府,40%來自企業(yè))開始實施為期10年的專項,其國家生物安全委員會(CNBS)直屬總統(tǒng)辦公室,負責制定政策并作為最高仲裁機構。2011年,巴西轉基因作物種植面積上升到全球第2位,主要包括大豆、玉米和棉花,總面積達3030萬公頃,占全球種植面積的19%,成為全球轉基因作物增長的引擎。2009年,巴西農(nóng)業(yè)科學院與德國巴斯夫公司共同研制的抗咪唑啉酮(Imidazolinone)除草劑大豆獲準商業(yè)化種植。2010年通過快速審批制度批準了8個轉基因產(chǎn)品,2011年又額外審批了6個。2011年,該國首次批準了聚合抗蟲和耐除草劑2種性狀大豆的生產(chǎn)。值得注意的是,2010年擁有巴西自主知識產(chǎn)權的轉基因抗病毒大豆獲批商業(yè)化生產(chǎn)(水稻和大豆為拉丁美洲的主要產(chǎn)品),證實了該國研發(fā)、生產(chǎn)及審批新型轉基因作物的能力(James,2011)。目前,農(nóng)產(chǎn)品出口約占巴西出口總值的35%,而大豆及其加工品出口占其出口總值的27%,達165億美元。可以說,農(nóng)業(yè)的成功是近年巴西經(jīng)濟快速起飛的重要標志之一。同為“金磚四國”之一的印度,2011年轉基因抗蟲棉種植面積達1060萬公頃,占其棉花總種植面積的88%,2002–2010年期間Bt棉花為印度農(nóng)民增收94億美元。非洲的南非、布基納法索以及埃及共計種植250萬公頃轉基因作物,肯尼亞、尼日利亞以及烏干達已經(jīng)開始了轉基因作物的田間實驗(James,2011)。目前,轉基因作物已在全球五大洲推廣應用,在減少農(nóng)藥施用、降低病蟲害損失、改善環(huán)境、減少勞動力投入上取得了巨大的經(jīng)濟效益。2011年全球轉基因作物種子銷售額約為130億美元,而轉基因作物商業(yè)化最終產(chǎn)品年產(chǎn)值為1600億美元(James,2011)。我國雖是種植轉基因植物最早的國家之一,但相比其它國家,種植面積在世界上的排名已從2005年之前的第4位下降至2006年的第5位和2011年的第6位,先后被同為“金磚國家”的巴西和印度趕超。2功能基因組研究成果中國是世界上最早開展農(nóng)業(yè)生物技術研究和應用的國家之一,已初步建立了世界上為數(shù)不多的包括基因克隆、功能鑒定、遺傳轉化、品種選育、安全性評價及應用推廣等完整的轉基因植物研究和產(chǎn)業(yè)化體系,擁有高產(chǎn)、抗病蟲、抗除草劑、抗旱耐鹽、營養(yǎng)品質改良等重要基因、調控元件及轉基因技術等自主知識產(chǎn)權。水稻、棉花、玉米等主要作物的基礎研究和應用研究已形成了自己的優(yōu)勢和特色,雖與美國相比整體實力仍有差距,但大幅領先于其它發(fā)展中國家。我國的農(nóng)業(yè)生物技術發(fā)展經(jīng)歷了早期的跟蹤國際科技前沿(1986–2000年)和近期的自主創(chuàng)新(2001–現(xiàn)在)2個階段。早期階段主要從事建立和優(yōu)化包括水稻、小麥(Triticumaestivum)、大豆和棉花等不同作物的組培再生及遺傳轉化體系(李向輝,1990;衛(wèi)志明和許智宏,1990;陳志賢等,1994;王國英等,1995,1996;盧愛蘭等,1996;梁輝等,1999;易自力等,2000,2001);水稻等重要農(nóng)作物遺傳圖譜的構建(毛龍和朱立煌,1993;張志永等,1998);對國際上已有相關研究的重要功能基因進行優(yōu)化并開展轉基因功能驗證及大田試驗,最具代表性的就是中國農(nóng)業(yè)科學院的Bt基因的克隆優(yōu)化和轉基因抗蟲棉的創(chuàng)制與推廣(謝道昕等,1991;郭三堆,1992;郭三堆等,1992),以及中國科學院微生物研究所創(chuàng)制并應用的轉基因抗病毒煙草等(周汝鴻和方榮祥,1993)。這一階段的工作為我國后期生物技術的發(fā)展奠定了堅實的基礎。進入21世紀,隨著我國在生物技術研究領域投入的加大,以及一批在生物技術基礎和應用研究領域學有所成的學者的回國加盟,在前期工作積累的基礎上,我國農(nóng)業(yè)生物技術研究進入了以基因組測序、重要農(nóng)藝性狀功能基因的定位及克隆和鑒定等為主的自主創(chuàng)新期。我國牽頭或參與組織完成了包括水稻(Fengetal.,2002;Yuetal.,2002)、黃瓜(Cucumissativus)(Huangetal.,2009a)、白菜(Brassicarapa)(Wangetal.,2011b)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)(Xuetal.,2011)、谷子(Setariaitalica)(Zhangetal.,2012a)、番茄(Satoetal.,2012)、二倍體棉花(Gossypiumraimondii)(Wangetal.,2012a)等重要農(nóng)作物的全基因組序列分析,A、D二倍體小麥基因組草圖也已完成(凌宏清等,賈繼增等,私人通訊)。此外,還開展了一些經(jīng)濟作物如西瓜(Citrulluslanatus)和柑橘(Citrussinensis)等和獨特資源植物如小鹽芥(Thellungiellasalsuginea)的測序及功能基因的克隆和鑒定工作(Guoetal.,2012;Wuetal.,2012;Xuetal.,2012)。在重要農(nóng)作物(特別是水稻)功能基因組研究方面也取得重要成果,已建成包括水稻大型突變體庫、全長cDNA文庫、生物芯片及轉錄組檢測等功能基因組研究平臺。更為重要的是,分離克隆了一大批控制高產(chǎn)、優(yōu)質、抗逆和營養(yǎng)高效等重要農(nóng)藝性狀的基因,如控制水稻籽粒大小及粒型基因GW2(Songetal.,2007)、GW5(Wengetal.,2008)、GS3(Fanetal.,2009;Maoetal.,2010)、GW8(Wangetal.,2012b)和qGL3(Qietal.,2012;Zhangetal.,2012b);大穗基因LP(Lietal.,2011b)、控制直立密穗基因DEP1(Huangetal.,2009b)和DEP2(Lietal.,2010a);控制水稻株型基因MOC1(Lietal.,2003)、EUI1(Luoetal.,2006;Zhuetal.,2006)、LAZY1(Lietal.,2007)、TAC1(Yuetal.,2007)、PROG1(Tanetal.,2008)、OsBAK1(Lietal.,2009)、DLT(Tongetal.,2009,2012)、IPA1(Jiaoetal.,2010)、OsARG(Maetal.,2013)、LPA1(Wuetal.,2013);控制抽穗期基因Ghd7(Xueetal.,2008)、RID1(Wuetal.,2008)、DTH8(Weietal.,2010)和LVP1(Sunetal.,2012);控制水稻光溫敏不育的分子調控機制(Longetal.,2008;Zhouetal.,2012);控制廣親和基因Sa(Wangetal.,2005)和S5(Yangetal.,2012);影響籽粒灌漿和品質性狀基因Waxy(Wangetal.,1990;Tianetal.,2009)、GIF1(Wangetal.,2010)、PHD1(Lietal.,2011a);控制水稻抗性的基因,如抗蟲基因CrylAb13(檀建新等,2002)、Cry1Ah1(Xueetal.,2011),水稻褐飛虱抗性基因Bph14(Duetal.,2009),抗病基因Pi-d2(Chenetal.,2006)、OsNPR1/NH1(Yuanetal.,2007;Fengetal.,2011)、Pid3(Shangetal.,2009)、OsBBI1(Lietal.,2011c);耐逆基因,如抗鹽基因SKC1(Renetal.,2005)、OsDREB1F(Wangetal.,2008),抗旱基因SDIR1(Zhangetal.,2007;Gaoetal.,2011)、SNAC1(Huetal.,2006)、OsSKIPa(Houetal.,2009)、OsWRKY30(Shenetal.,2012),耐低溫和耐旱基因OsbZIP52(Liuetal.,2012);控制營養(yǎng)高效吸收利用的基因,如磷營養(yǎng)高效基因OsPFT1(Yietal.,2005)、OsPHR2(Zhouetal.,2008a)和LTN1(Huetal.,2011),鉀吸收利用基因AKT1(Xuetal.,2006),鋅高效利用基因OsMT1a(Yangetal.,2009);新型高效抗除草劑EPSPS基因(Jinetal.,2007;Yanetal.,2011)等。除了在水稻功能基因組學上的進展以外,在其它作物如玉米、小麥及大豆等的重要功能基因鑒定及生物技術育種改良等研究方面也取得了很大進展(Liaoetal.,2008;Zhouetal.,2008b;Laietal.,2010;Caoetal.,2011;Haoetal.,2011)。在植物基因調控元件的分離鑒定(謝迎秋等,2000;Chenetal.,2001;Sietal.,2002,2003)、高通量基因克隆鑒定技術(Liuetal.,2002,2005;Linetal.,2003;LiuandChen,2007;Lietal.,2010b;Wangetal.,2011a)、無標記系統(tǒng)(Baietal.,2008)等轉基因技術研發(fā)上也做了大量工作。這些重要基因和調控元件不僅具有自主知識產(chǎn)權,也為分子設計育種奠定了堅實的基礎。我國現(xiàn)已批準轉基因棉花、番茄、甜椒(Capsicumfrutescens)、矮牽牛(Petuniahybrida)、楊樹(Populusalba)和番木瓜的商業(yè)化生產(chǎn),但實際上僅有轉基因棉花和番木瓜真正進入市場應用。1997年,我國批準轉基因抗蟲棉商業(yè)化生產(chǎn)伊始,美國孟山都公司轉基因棉花占中國抗蟲棉市場的95%。2011年我國抗蟲棉種植面積達到390萬公頃,占全國棉花總種植面積的71%,目前自主抗蟲棉品種已占中國抗蟲棉市場的95%以上(Luetal.,2012)。至2011年,全國累計種植抗蟲棉約2500萬公頃,14年的應用,減少農(nóng)藥用量80多萬噸,新增產(chǎn)值440億元,農(nóng)民增收250億元。單因種植抗蟲棉,每年減少的化學農(nóng)藥使用量,相當于我國化學殺蟲劑年生產(chǎn)總量的7.5%左右;棉農(nóng)的勞動強度和防治成本顯著下降,棉田生態(tài)環(huán)境得到明顯改善。可以說轉基因棉花在減少農(nóng)藥投入、增加產(chǎn)量和農(nóng)民增收方面起了重要作用(Huangetal.,2002,2005;Wangetal.,2009)。我國在玉米和水稻的分子改良上也有非常好的技術儲備,2009年批準了抗蟲轉基因水稻和轉植酸酶玉米,但仍未進入商業(yè)化生產(chǎn)應用。可以說,中國的農(nóng)業(yè)生物技術在基礎性研究領域與國際前沿水平相距較小,但在應用方面還存在較大的差距。另一方面,中國也是世界上最大的生物技術產(chǎn)品消費市場之一。因此,如何充分利用我國在該領域技術上的優(yōu)勢,培育革命性新品種并推動其產(chǎn)業(yè)化進程,對保障我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和糧食安全具有重要的戰(zhàn)略意義。3抗基肥間相關基因的嵌入轉基因作物自商業(yè)化以來,一直面臨著安全性的質疑,公眾最為擔心的是轉基因植物是否能夠通過花粉與近源種雜交從而產(chǎn)生對農(nóng)業(yè)有害的超級雜草,以及轉基因作物和由此衍生的轉基因食品對動物和人類會否產(chǎn)生直接的危害?從科學角度來說,這些質疑是合理的,也需要且只能通過科學來回答。有關轉基因安全性最為典型的有以下幾個案例。1999年康奈爾大學Losey指稱,用拌有轉基因抗蟲玉米花粉的馬利筋(Asclepiascurassavica)葉片飼喂帝王蝶(Danausplexippus)幼蟲,發(fā)現(xiàn)幼蟲生長緩慢,死亡率高達44%,從而認為抗蟲轉基因作物對非靶標昆蟲產(chǎn)生威脅(Loseyetal.,1999)。由于該實驗是在室內進行的,不能反映田間情況,且沒有提供花粉量的數(shù)據(jù)而遭到同行科學家的質疑(Beringer,1999;Crawley,1999)。上世紀90年代初,加拿大公眾也擔心早期抗除草劑轉基因油菜的種植會導致超級雜草的產(chǎn)生,造成生態(tài)災難。Crawley等(1993)通過詳細的研究證明,轉基因油菜與普通油菜相比在自然生態(tài)種群中沒有任何生存優(yōu)勢。我國種植轉基因抗蟲棉伊始,也有很多質疑的聲音。后來的研究發(fā)現(xiàn),抗蟲棉的種植不僅顯著減少了農(nóng)藥的使用量,而且由于農(nóng)藥使用量的減少,捕食性天敵數(shù)量增加,其它害蟲如蚜蟲的數(shù)量也顯著減少,有助于通過區(qū)域性天敵控制害蟲,促進生物防治,改善生態(tài)環(huán)境(Luetal.,2010,2012)。2001年Quist和Chapela宣稱,在墨西哥南部Oaxaca地區(qū)6個玉米樣本中發(fā)現(xiàn)了一段CaMV35S啟動子序列,以及一段與Novartis種子公司轉基因抗蟲玉米所含“Adh1基因”相似的基因序列(QuistandChapela,2001)。后來證明所測出的CaMV35S啟動子為假陽性(Christou,2002;Kaplinskyetal.,2002)。隨后,墨西哥科學家于2003和2004年連續(xù)2年對從Oaxaca地區(qū)125個玉米田塊收集的153746份材料逐一進行檢測,證明墨西哥任何地區(qū)的材料里都沒有發(fā)現(xiàn)CaMV35S啟動子和來自農(nóng)桿菌的NOSterminator(Ortiz-Garcíaetal.,2005)。那么轉基因食品有沒有安全性問題?人們更關心的應該是已經(jīng)大量進入到我們生活中的轉基因作物,如轉基因大豆、轉基因玉米和轉基因棉花等。它們分別轉入了什么基因?是否會影響人體健康?是否會給環(huán)境帶來不良影響?這些問題都需要我們用科學來回答。目前進入商品化生產(chǎn)的轉基因玉米和棉花,主要轉入的是Bt抗蟲基因和EPSPS抗除草劑基因,而大豆主要轉入的是EPSPS抗除草劑基因。以轉基因Bt抗蟲作物為例,Bt蛋白為什么能夠殺死昆蟲?Bt進入昆蟲的消化道,昆蟲的消化道是堿性環(huán)境,Bt蛋白和昆蟲消化道上的受體結合,引起腸穿孔,從而導致害蟲生長緩慢,直至死亡。人的消化道結構和昆蟲不一樣,而且人的腸道環(huán)境是酸性的,Bt蛋白進入胃中后很快在胃液中被消化降解為氨基酸,對人體消化道沒有任何作用。也就是說,Bt基因的殺蟲功能具有很強的選擇性,只在鱗翅目昆蟲的堿性消化道中發(fā)揮作用,對人和哺乳動物都不會產(chǎn)生影響(Sheltonetal.,2002)。抗除草劑性狀由于其巨大的經(jīng)濟效益和環(huán)境效益,成為作物的第一大改良性狀。2011年抗除草劑大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜以及苜蓿種植面積達9390萬公頃,占全球轉基因作物種植總面積的59%。其中使用最為廣泛的抗除草劑基因是從根瘤農(nóng)桿菌中分離的編碼455個氨基酸的抗草甘膦基因CP4-EPSPS。安全性評價表明,CP4-EPSPS蛋白在哺乳動物消化系統(tǒng)中極易分解,小鼠經(jīng)口食入高達572mg·kg–1(高于轉基因大豆、玉米等植物中的1300倍)的CP4-EPSPS蛋白,亦無不良影響,其在胃中的半衰期小于15秒,在腸系統(tǒng)中小于10分鐘。以上結果結合種子成分分析及動物營養(yǎng)研究表明,轉基因抗草甘膦大豆對人和動物是安全的(Harrisonetal.,1998)。聯(lián)合國糧農(nóng)組織2007年的數(shù)據(jù)顯示,美國當年大豆產(chǎn)量的41%用于出口,其余主要用于美國國內消費,其中93%為食用;美國每年生產(chǎn)玉米達3億3千多萬噸,其中僅有17.5%用于出口,而美國國內食用消耗占28.7%。迄今為止,美國已種植轉基因作物16年,包括嬰兒食品在內,美國市場轉基因食品已超過3000種,直接使用人數(shù)超過2億人。可以說,美國既是轉基因作物生產(chǎn)大國,也是轉基因產(chǎn)品消費大國。16年的歷史應該是空前規(guī)模的人體實驗,到現(xiàn)在為止并沒有發(fā)現(xiàn)1例轉基因食品的安全事故。按照食品安全定義,一方面轉基因食品不含有毒有害物質,更不要說量的問題。從科學上來說,Bt蛋白不是有毒物質,且在作物籽粒中的含量約為2μg·g–1,這個濃度甚至低于國家稻米中農(nóng)藥殘留標準。所以說,轉基因食品并不構成食品安全問題。更何況,轉基因作物的研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化受到嚴格的安全管理。在中國,為了規(guī)范轉基因作物的研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化,2001年國務院頒布了《農(nóng)業(yè)轉基因生物安全管理條例》;2002年農(nóng)業(yè)部又出臺了《農(nóng)業(yè)轉基因生物安全評價辦法》、《農(nóng)業(yè)轉基因生物標識管理辦法》、《農(nóng)業(yè)轉基因生物進口安全管理辦法》和《農(nóng)業(yè)轉基因生物加工審批辦法》等多項管理辦法,從保障生態(tài)環(huán)境安全、人體健康和農(nóng)產(chǎn)品貿易秩序等方面進行了全方