植物組培苗培養(yǎng)與管理 組培苗培養(yǎng)與管理

項目五組培苗培養(yǎng)與管理任務10組培苗的培養(yǎng)任務11組培苗馴化與移栽【知識點】組培易發(fā)問題的原因與調(diào)控措施組培苗培養(yǎng)條件，組培苗的特點，組培苗馴化方法【技能點】能解決組培易發(fā)問題，培養(yǎng)健壯組培苗會進行組培苗移栽養(yǎng)護素質(zhì)要求：培養(yǎng)學生無菌意識、創(chuàng)新意識、團隊合作意識和生態(tài)環(huán)保意識；具有任務執(zhí)行力，規(guī)范操作、注意安全；科學嚴謹、實事求是的工作態(tài)度。任務10組培苗的培養(yǎng)一、組培苗培養(yǎng)1、培養(yǎng)程序1）初代培養(yǎng)指在組培過程中，最初建立的外植體無菌培養(yǎng)階段，即無菌接種完成后，外植體在適宜的光、溫、氣等條件下被誘導成無菌短枝（或稱莖梢）、不定芽（叢生芽）、胚狀體或原球莖的過程。也稱為誘導培養(yǎng)。

由于外植體來源復雜，又攜帶較多的雜菌，初代培養(yǎng)一般是比較困難的，是植物組培成功的關鍵技術之一。2）繼代培養(yǎng)將初代培養(yǎng)誘導產(chǎn)生的愈傷組織、芽、苗、胚狀體或原球莖等重新分割，接種到新配制的培養(yǎng)基上，進一步增殖擴繁的培養(yǎng)過程稱為繼代培養(yǎng)，也稱增殖培養(yǎng)。

通過初代培養(yǎng)多獲得的不定芽、無菌短枝、胚狀體或原球莖等無菌材料被稱為中間繁殖體。中間繁殖體可以按幾何系數(shù)擴繁。例如：2株苗為基礎，每棵苗的繁殖系數(shù)為3（即一株苗剪成3段接種，培養(yǎng)一段時間后每段又形成3株苗），那么經(jīng)過10代繁殖，將生成多少株苗？2×310=1180963）壯苗與生根壯苗培養(yǎng)生根培養(yǎng)：NAA和IBA是最常用于誘導生根的生長素，使用濃度一般為0.1-10.0mg/L。2、組培苗培養(yǎng)條件1）溫度：培養(yǎng)室內(nèi)的溫度通常是控制在25±2℃。2）光照：植物所需的光照強度為1000-5000lx，培養(yǎng)室每日光照10-16h。3）濕度：容器內(nèi)的濕度?？杀３衷?00%，培養(yǎng)室的相對濕度一般應保持在70%--80%之間。4）通氣：在固體培養(yǎng)中，不要把培養(yǎng)物全部埋入培養(yǎng)基內(nèi)，以避免氧氣不足。

培養(yǎng)室要適當通風換氣，改善室內(nèi)的通氣狀況，每次通風后要進行一次消毒，避免引起培養(yǎng)物污染。1.試管苗培養(yǎng)條件。2.培養(yǎng)程序。小結(jié)??？？二、組培污染的原因及防治組培常見問題1、培養(yǎng)基污染來源與防治（1）培養(yǎng)基污染可能的來源培養(yǎng)容器操作器械接種室的環(huán)境操作者本人培養(yǎng)室的環(huán)境外植體培養(yǎng)基本身污染的病原分為細菌和真菌兩大類（2）細菌污染原因分析材料帶菌培養(yǎng)基滅菌不徹底操作人員的不慎使用了未經(jīng)充分滅菌的工具（鑷子、培養(yǎng)皿等）手接觸材料或器皿邊緣，使微生物落入材料或器皿防治：1、接種前，洗手，用70%酒精棉球擦拭雙手；戴口罩，不說話，防止呼吸時呼出的細菌所引起；每接一瓶材料后用酒精擦手指。防治：2、提高外植體滅菌技術，選取帶菌少的材料，微生物少的季節(jié)和時間。3、每個培養(yǎng)周期不宜過長。4、培養(yǎng)瓶容器的封口類型。防治：5、接種用的工具每接一瓶至少要灼燒滅菌一次。6、凡是污染材料，均要高壓蒸汽滅菌，或用70%酒精殺菌，降低污染源。（2）真菌污染原因分析接種室的空氣本身不潔凈、灰塵很多超凈工作臺的過濾裝置失效培養(yǎng)用器皿的口徑過大操作不慎等原因引起防治：1、無菌室內(nèi)安裝空氣循環(huán)過濾裝置，通過紫外線照射滅菌。2、超凈工作臺提前開機20min以達到空氣的充分過濾滅菌。3、接種，用70%酒精棉球擦拭雙手，戴口罩，不聊天；每接一瓶后用酒精擦手指。4、接種時要嚴格操作，接種工具要燒紅，不碰觸任何物品，打開瓶蓋時動作要輕及去掉瓶塞后瓶子應拿成斜角等。5、培養(yǎng)瓶容器的封口類型。6、每個培養(yǎng)周期不宜過長。7、凡是污染材料先高原蒸汽滅菌，或用70%酒精殺菌，降低污染源。8、培養(yǎng)室安裝凈化設備，并勤開紫外燈滅菌，以及酒精噴霧和冰醋酸熏蒸滅菌。

提問針對操作流程：外植體取材——預處理——消毒——接種——組培苗培養(yǎng)與管理，分析每個步驟引起的污染源2、培養(yǎng)常見問題及對策1）污染所謂污染是指在組織培養(yǎng)過程中，有細菌、真菌等微生物的侵染，在培養(yǎng)基的表面滋生大量菌斑，造成培養(yǎng)材料不能生長和發(fā)育的現(xiàn)象。（1）污染識別若污染菌類是零星分散在培養(yǎng)基中，則可確定是人為引起的污染。若從培養(yǎng)基以下開始長菌，發(fā)生時間較早，且有從里向外的趨勢，則說明是切口引起的污染。若是外植體帶菌，菌類從材料的培養(yǎng)基以上部位長起，且發(fā)生在5天以后，則說明是材料帶的內(nèi)生菌。（2）來源材料表面消毒不徹底，植物材料帶入培養(yǎng)過程。植物內(nèi)生菌隨材料帶入培養(yǎng)過程。無菌操作過程中外界環(huán)境進入培養(yǎng)容器造成。（3）種類細菌性污染：培養(yǎng)基某一位置或培養(yǎng)材料周圍出現(xiàn)黏液狀或渾濁的水漬狀痕，有時呈現(xiàn)發(fā)酵狀泡沫。接種后1-2天可見。真菌性污染：培養(yǎng)基污染部位發(fā)霉，顏色黝黑、白、黃等。接種后3-5天或更長時間出現(xiàn)。（4）污染的防止選擇合適的植物材料：幼嫩材料、溫室材料、清潔材料、草本材料、中午陽光最強時的材料帶菌少。嚴格滅菌：對難滅菌材料采用多次滅菌法，對材料內(nèi)部的細菌，可在培養(yǎng)基中添加抗生素來解決。污染的防止合理安排繁殖程序：將獲得的無菌培養(yǎng)物一部分保存起來，分批繁殖和復檢后再提供給大規(guī)模生產(chǎn)。操作規(guī)范：培養(yǎng)室要求清潔、密閉、接種室要經(jīng)常用紫外線照射、冰乙酸熏蒸、70%酒精噴霧殺菌等。2）褐變褐變（又稱褐化）是指培養(yǎng)材料向培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì)，致使培養(yǎng)基逐漸變褐，培養(yǎng)材料也隨之變褐，甚至死亡的現(xiàn)象。（1）成因切割外植體時，體內(nèi)的多酚氧化酶被激活，使細胞里的酚類物質(zhì)氧化成棕褐色的醌類物質(zhì)，當擴散到培養(yǎng)基后，會抑制其他酶的活性，從而影響所接種外植體的培養(yǎng)。（2）影響褐變的因素基因型：褐變和品種有關，在多酚氧化酶活性上的差異，對不同的品種分別進行處理。生理狀態(tài)：褐變程度的輕重常與取樣外植體組織的生理狀態(tài)有關；處于幼齡期的植物材料或幼嫩的組織褐變程度不明顯，而從成年的植株或老熟的組織采收的外植體，含醌類物質(zhì)較多，容易褐變。培養(yǎng)基成分：無機鹽濃度過高，會使某些觀賞植物的褐變程度增加；細胞分裂素的水平過高會刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐變現(xiàn)象加深。外植體大?。翰牧咸?，在培養(yǎng)過程中容易褐變。外植體組織的受傷程度：在取材料時，應盡量減少傷口面積，創(chuàng)傷面要盡量平整。影響褐變的因素培養(yǎng)材料的繼代時間：培養(yǎng)過程中，如果推遲繼代時間，會導致材料的褐變，最終材料全部死亡。滅菌的化學藥品：楊樹葉片作外植體，用70%乙醇時間處理過長，容易褐變。溫度和光照：光照國強、溫度過高、培養(yǎng)時間過長等，均可使多酚氧化酶的活性提高，加速培養(yǎng)物的褐變程度。(3)克服外植體褐變的方法適合外植體和培養(yǎng)條件：選擇生長處于旺盛的外植體，可使褐變現(xiàn)象明顯減輕。無機鹽成分，植物生長物質(zhì)水平，適宜溫度均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。連續(xù)轉(zhuǎn)移（繼代培養(yǎng)）：對容易褐變的材料可連續(xù)繼代培養(yǎng)，減輕醌類物質(zhì)對外植體的毒害。加入抗氧化劑：使用半胱氨酸，抗壞血酸、PVP等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕褐變現(xiàn)象。另外，使用0.1-0.5%的活性炭對防止褐變也有較為明顯的效果。3）試管苗玻璃化當植物材料不斷地進行離體繁殖時，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會呈半透明水漬狀，這種現(xiàn)象通常稱為玻璃化（也稱為超水化現(xiàn)象）。發(fā)生玻璃化的試管苗稱為玻璃化苗。（1）特點形態(tài)解剖學特點：整株矮小腫脹、失綠；葉片皺縮成縱向卷曲、脆弱易碎；葉表缺少角質(zhì)層蠟質(zhì)，沒有功能性氣孔，不具柵欄組織，僅有海綿組織。生理生化特點：玻璃化苗體內(nèi)含水量與可溶性糖含量高，但干物質(zhì)、葉綠素、蛋白質(zhì)、纖維素和木質(zhì)素含量低。(2)玻璃苗的危害呈現(xiàn)玻璃化的試管苗，其莖、葉表面無蠟質(zhì)，體內(nèi)的極性化合物水平較高，細胞持水力差，植株蒸騰作用強，無法進行正常移栽。玻璃廟生長緩慢、繁殖系數(shù)下降，如果再在相同的培養(yǎng)基上和相同的培養(yǎng)條件下進行繼代培養(yǎng)后死亡。玻璃苗生根困難。（3）控制和克服玻璃化的措施使用固體培養(yǎng)基：增加瓊脂濃度，降低培養(yǎng)基水勢，造成細胞吸水阻遏；提高瓊脂純度，也可降低玻璃化。適當降低培養(yǎng)基中細胞分裂素和赤霉素的濃度。提高光照強度，玻璃苗放于自然光下幾天后莖、葉變紅，玻璃化逐漸消失，因自然光中的紫外線能促進試管苗成熟，加快木質(zhì)化。使用透氣性好的封口材料，改善氧氣的供應狀況，降低培養(yǎng)容器內(nèi)部環(huán)境的相機濕度。（3）控制和克服玻璃化的措施培養(yǎng)基中加入間苯三酚或根皮苷、青霉素鉀、活性炭、聚乙烯醇（PVA）均可有效抑制玻璃苗的發(fā)生。青霉素G鉀（2-6mg/L）能有效防治菊