雙波長高效液相色譜法同時測定敗醬草中原兒茶酸、綠原酸及咖啡酸的含量

雙波長高效液相色譜法同時測定敗醬草中原兒茶酸、綠原酸及咖啡酸的含量

《神農(nóng)本草經(jīng)》記載了完整的草地，也被稱為苦齋、路腸、澤湖等多年生草本植物。這是白色星科的一種常見草本植物。它是白色星科黃鼠（p.vamos）和白色星（p.villosa）jussieu的干燥草地。有清熱解毒,消癰排膿,祛瘀止痛的功效,為治療腸癰腹痛的首選藥物之一?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有抗炎、抗病毒、保肝利膽、抗腫瘤等作用,臨床上用于治療癰腫、結(jié)腸炎和肝炎、慢性盆腔炎等。敗醬草用藥歷史悠久,資源豐富,但有關(guān)敗醬草藥材質(zhì)量評價指標和有效成分的研究較少?，F(xiàn)行中國藥典未對其藥材進行相關(guān)的規(guī)定,僅收載于地方中藥材標準,如《湖南省中藥材標準》,僅規(guī)定了藥材的性狀、顯微鑒別、水分、總灰分檢查等項目,無薄層鑒別和含量測定項,因此有必要制定敗醬草客觀、專屬、科學(xué)的質(zhì)量控制方法。敗醬草中含有有機酸、黃酮、環(huán)烯醚萜、皂苷等類化合物,其中有機酸類是發(fā)揮抗炎作用的主要活性成分,筆者通過前期的試驗,首次從敗醬草中提取出原兒茶酸、綠原酸及咖啡酸,未見文獻對此3種成分的報道,而研究表明原兒茶酸具有抗HBV、止血等作用;綠原酸、咖啡酸具有抗病毒、抗菌、利膽等藥理作用,這與敗醬草的主要藥效相吻合,表明檢測敗醬草中原兒茶酸、綠原酸及咖啡酸的含量具有重要的意義。本文建立了同時測定敗醬草中此3個成分含量的方法,并考察了20個批次藥材中指標成分的含量,為敗醬草的質(zhì)量控制提供了可靠的參考依據(jù)。1參全草的藥品、藥劑和藥品Agilent1100Series高效液相色譜儀,配備G1311A四元梯度泵、G1313A自動進樣器、G1315A二極管陣列檢測器、Agilent化學(xué)工作站(美國安捷倫科技有限公司);AG-285電子天平(瑞士Mettler公司);KS-600D超聲波清洗器(寧波科生儀器廠)。敗醬草藥材購自于長沙市各大藥房,來源見表2,經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)院藥劑科雷鵬副教授鑒定為敗醬科黃花敗醬(PatriniascabiosifoliaFischerexTreviranus)、白花敗醬[P.villosa(Thunberg)Jussieu]的干燥全草。對照品原兒茶酸(批號:MUST-11103006,純度:≥98%)和綠原酸(批號:MUST-12031401,純度:≥98%)購自成都曼思特生物科技有限公司;咖啡酸(批號:885-200001)購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈(色譜純,美國天地有限公司),水為純凈水,其余試劑為分析純。2方法和結(jié)果2.1gc/ms色譜條件分別精密稱取對照品原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸適量,分別加甲醇超聲(300W,40kHz)溶解并定容,即得濃度分別為136.6μg·mL-1、186.4μg·mL-1、441.6μg·mL-1的對照品儲備液。分別精密移取對照品儲備液適量,用甲醇稀釋成原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸濃度分別為10.93μg·mL-1、61.51μg·mL-1、6.18μg·mL-1的混合對照品溶液。敗醬草藥材粉碎(過3號篩),取其干燥粉末約0.5g,精密稱定,置25mL量瓶中,加含5%甲酸的60%甲醇溶液約20mL,超聲提取(300W,40kHz)30min,取出放冷,加提取溶劑定容至刻度,搖勻,經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。色譜柱:OdyssilC18(250mm×4.6mm,5μm);流動相:乙腈–0.1%磷酸(10∶90);流速:1.0mL·min-1;檢測波長:260nm、327nm;柱溫:25℃;進樣量:5μL。在上述條件下,原兒茶酸、綠原酸及咖啡酸理論板均不低于8000,對照品和樣品色譜圖見圖1。分別精密移取“2.1.1”項下原兒茶酸對照品儲備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL;綠原酸對照品儲備液0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0mL;咖啡酸對照品儲備液0.08、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mL,分別置10mL量瓶中,加甲醇定容至刻度。按“2.2”項下色譜條件,分別進樣5μL,記錄峰面積。以峰面積Y(A)為縱坐標,進樣量X(μg)為橫坐標,進行線性回歸,得到原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸回歸方程分別為:Y=3472.4X-14.593r=0.9997Y=2771.8X-3.6113r=0.9999Y=4923.2X-14.120r=0.9996結(jié)果表明,原兒茶酸進樣量在3.42×10-2～3.42×10-1μg、綠原酸進樣量在4.66×10-2～4.66×10-1μg、咖啡酸進樣量在1.77×10-2～2.21×10-1μg,與峰面積均呈良好的線性關(guān)系。2.4精密度測試2.5穩(wěn)定性試驗2.6加樣回收率試驗取“2.1.1”項下對照品溶液適量,經(jīng)甲醇逐級稀釋后進樣測定,按信噪比(S/N=3)確定檢測限濃度分別為原兒茶酸(0.144μg·mL-1),綠原酸(0.203μg·mL-1),咖啡酸(0.204μg·mL-1);按信噪比(S/N=10)確定定量限濃度分別為原兒茶酸(0.488μg·mL-1),綠原酸(0.678μg·mL-1),咖啡酸(0.679μg·mL-1)。精密稱取已知含量敗醬草藥材粉末約0.25g,共6份,置25mL量瓶中,精密移取原兒茶酸對照品(136.6μg·mL-1)1.0mL、綠原酸對照品(186.4μg·mL-1)4.0mL、咖啡酸對照品(441.6μg·mL-1)0.16mL儲備液,并按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.2”項下色譜條件測定,計算回收率。結(jié)果見表1。2.8樣品的質(zhì)量分析3討論3.1提取效率的比較本實驗對比了50%、60%、70%、80%、90%和100%甲醇、5%甲酸的50%甲醇、5%甲酸的60%甲醇以及5%甲酸的70%甲醇溶液對目標成分的提取效率,結(jié)果顯示:加入甲酸的不同濃度甲醇溶液,提取效率明顯高于不同濃度的甲醇溶液;而含5%甲酸的不同濃度甲醇溶液中,含5%甲酸的60%甲醇溶液有較高的提取效率,故本實驗采用其作為提取溶劑。3.2流動相系統(tǒng)的確定本實驗分別對3個待測成分對照品溶液在紫外200～400nm進行掃描,結(jié)果表明綠原酸、咖啡酸在327nm處有最大吸收,原兒茶酸在260nm處有最大吸收;260nm條件下3個待測成分均有吸收,但咖啡酸的響應(yīng)值低,且原兒茶酸在327nm近無紫外吸收,為保證被測成分均能得到較好的響應(yīng),綜合考慮設(shè)定在260、327nm波長下同時測定。在確定流動相系統(tǒng)時,分別對甲醇-水、乙腈-冰醋酸、乙腈-磷酸系統(tǒng)進行了考察,結(jié)果以乙腈-磷酸系統(tǒng)作為流動相效果最好;同時考察了乙腈–0.1%磷酸(30∶70;25∶75;10∶90)作為流動相時的色譜圖情況,當(dāng)乙腈–0.1%磷酸(10∶90)時,色譜峰峰形尖銳,分離效果好,且基線穩(wěn)定,以此確定其為流動相。3.3色譜柱及色譜柱的影響本實驗換用PromosilC18(250mm×4.6mm,5μm)色譜柱時,調(diào)整乙腈和0.1%磷酸的比例,原兒茶酸、綠原酸及咖啡酸亦能達到較好的分離效果,表明該方法耐用性較好。3.4最佳藥材配方本文采用RP-HPLC法測定了20個批次不同產(chǎn)地敗醬草中3個有機酸成分的含量。結(jié)果顯示:原兒茶酸、綠原酸及咖啡酸為敗醬草中的共有成分,其中原兒茶酸含量在0.176～0.534mg·g-1、綠原酸含量在0.950～7.26mg·g-1、咖啡酸含量在0.046～0.340mg·g-1,表明3個成分含量相對穩(wěn)定,便于進一步的質(zhì)量控制;3個指標成分的含量存在一定差異,但每批次藥材中均以綠原酸的含量最高,原兒茶酸次之,咖啡酸的含量相對較低;經(jīng)過驗證,本文所建立的方法簡便、快速、具有良好的重復(fù)性,適合敗醬草中3個指標成分的含量測定。2.1.1對照溶液2.1.2試驗溶液的制備2.2在鉻條件下和系統(tǒng)適用性試驗中2.3溶液穩(wěn)定性試驗精密移取混合對照品溶液5μL,按“2.2”項下色譜條件重復(fù)進樣6次,以峰面積計算原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸的RSD分別為0.2%、0.5%、0.3%,結(jié)果表明儀器精密度良好。取同一供試品溶液,按“2.2”項下色譜條件測定,分別于0,2,4,6,8,12h進樣測定,記錄色譜圖,考察峰面積的變化,結(jié)果原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸峰面積的RSD分別為1.0%、0.8%、0.9%,表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取同批次敗醬草粉末,按“2.1.2”項下方法制備6份供試品溶液,以“2.2”項下色譜條件進行含量測