第12章-抗生素類藥物的分析1

第十一章抗生素類藥物的分析第一節(jié)概述抗生素的定義抗生素是細(xì)菌、放線菌和真菌等微生物的代謝產(chǎn)物，對(duì)各種病原微生物有強(qiáng)大的抑制或殺滅作用?？股氐膩?lái)源1.生物合成（發(fā)酵）2.化學(xué)合成或半合成抗生素質(zhì)量的復(fù)雜性

產(chǎn)品穩(wěn)定性差分子結(jié)構(gòu)大多不穩(wěn)定，降解后療效下降、失效或增加毒副作用發(fā)酵過(guò)程不易控制易受污染生產(chǎn)工藝復(fù)雜發(fā)酵液中雜質(zhì)無(wú)機(jī)鹽、脂肪、各種蛋白質(zhì)、各種降解產(chǎn)物、色素、熱原、毒性物質(zhì)增加異常毒性、細(xì)菌內(nèi)毒素、熱原、降壓物質(zhì)、無(wú)菌[檢查]含量測(cè)定方法（一）生物學(xué)方法測(cè)定抗生素抑菌或殺菌的能力優(yōu)點(diǎn)1、與臨床效果一致2、靈敏度高3、干擾物質(zhì)少缺點(diǎn)1、操作繁瑣2、培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)2、測(cè)定誤差大（二）化學(xué)及物理化學(xué)方法以理化方法測(cè)定主藥含量?jī)?yōu)點(diǎn)1.準(zhǔn)確度高2.簡(jiǎn)單、快速1.不一定代表生物效價(jià)缺點(diǎn)2.易受雜質(zhì)干擾分類（按結(jié)構(gòu)與性質(zhì)）：β–內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類、多肽類、抗腫瘤類林可霉素類、其他抗生素類第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類抗生素

青霉素類頭孢菌素類青霉素（青霉素G、芐青霉素）氨芐西林

（氨芐青霉素）阿莫西林

（羥氨芐青霉素）普魯卡因青霉素頭孢氨芐頭孢拉定頭孢羥氨芐頭孢噻吩鈉酸性結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、Na與堿金屬(Na+、K+)成鹽

（一）羧基易溶于水

與有機(jī)堿(普魯卡因)成鹽難溶于水普魯卡因青霉素（二）手性C(5%頭孢唑啉鈉溶液–18～–24°)頭孢菌素類C6C7青霉素類C3C5C6

旋光性﹡﹡﹡﹡﹡

（三）共軛體系頭孢菌素類母核有共軛體系

青霉素類母核無(wú)明顯UV多數(shù)有苯環(huán)取代基

UV青霉素鈉UV7-20（四）β–內(nèi)酰胺環(huán)水溶液不穩(wěn)定干燥純凈穩(wěn)定不穩(wěn)定性因素四元環(huán)張力大酰胺鍵易水解（某些金屬離子）（溫度）某些氧化劑例青霉素的降解反應(yīng)青霉素青霉噻唑酸H2O/OHˉ青霉素酶青霉酸H2OpH2100℃α–青霉噻唑?；u胺酸NH2OH青霉烯酸pH4青霉胺CO2青霉醛HgCl2二、K+、Na+反應(yīng)（一）鑒別焰色→鮮黃色+醋酸氧鈾鋅→↓黃

Na+

焰色→紫色+0.1%四苯硼鈉+Ac→↓白

K+（二）呈色反應(yīng)1.羥肟酸鐵反應(yīng)β-內(nèi)酰胺類NaOH呈色Fe3+/3H+H+Fe3+/3（紅、棕、褐）2、與H2SO4-HNO3反應(yīng)頭孢菌素類3.茚三酮反應(yīng)△α-氨基α-氨基、伯胺某些羥基胺類酮式烯醇式茚三酮茚三酮縮合藍(lán)紫色4.雙縮脲反應(yīng)β-內(nèi)酰胺類（開(kāi)環(huán)分解）似肽鍵藍(lán)紫色5.與變色酸-硫酸反應(yīng)活潑“-CH2-”青霉素阿莫西林氨芐西林△（分解）變色酸顯色150℃（縮合）（縮合）6.與重氮苯磺酸反應(yīng)（偶合）酚羥基頭孢哌酮（偶合）7.與銅鹽反應(yīng)橄欖綠色NaOH專屬反應(yīng)（三）沉淀反應(yīng)1.遇酸→↓在過(guò)量HCl或有機(jī)溶劑中溶解2.有機(jī)胺鹽反應(yīng)（1）重氮化-偶合反應(yīng)重氮化-偶合反應(yīng)芳伯氨基普魯卡因普魯卡因青霉素（2）與三硝基苯酚反應(yīng)△二芐基乙二胺mp三硝基苯酚光譜法（四）1、UV法樣品、分解產(chǎn)物Cu2+頭孢氨芐λmax=262nm青霉素V鈉A280nm/A264nm=1.30～1.50Cu2+pH3.8△氯唑青霉素3410.682雙氯青霉素3420.653苯唑青霉素3391.328(nm)2、IR法β-內(nèi)酰胺環(huán)酰胺3、NMR法利用不同結(jié)構(gòu)的原子核在D2O中有不同的NMR光譜進(jìn)行鑒別JP以吸收峰頻率對(duì)峰強(qiáng)度進(jìn)行作圖主要研究原子核的磁化性質(zhì)及其在外磁場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)規(guī)律硫酸慶大霉素NMR譜7-08硫酸慶大霉素NMR色譜法（五）1、TLC法對(duì)照品對(duì)照法2、HPLC法三、含量測(cè)定（水解）碘量法（一）1.原理水解產(chǎn)物定量過(guò)量剩余β-內(nèi)酰胺類ChP反應(yīng)分兩步進(jìn)行：1.水解反應(yīng)(按化學(xué)計(jì)算量進(jìn)行)2.氧化-還原反應(yīng)(無(wú)固定的量關(guān)系，受溫度、PH值和時(shí)間等因素影響，應(yīng)嚴(yán)格控制反應(yīng)條件并采用標(biāo)準(zhǔn)品平行對(duì)照測(cè)定)第一步第二步例注射用普魯卡因青霉素含量測(cè)定取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，精密稱取約0.12g，置100ml量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置碘瓶中，加1mol/L氫氧化鈉溶液1ml放置20分鐘，再加1mol/L鹽酸溶液1ml與醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.5)5ml，精密加入碘滴定液(0.01mol/L)15ml，密塞，搖勻，在20～25℃暗處放置20分鐘，用硫代硫酸鈉滴定液（0.01mol/L）滴定，至近終點(diǎn)時(shí)加淀粉指示液，繼續(xù)滴定并強(qiáng)力振搖，至藍(lán)色消失；另精密量取供試品溶液5ml，置碘瓶中，加醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.5）5ml，精密加入碘滴定液（0.01mol/L）15ml，密塞，搖勻，在暗處放置20分鐘，用硫代硫酸鈉滴定液（0.01mol/L）滴定，作為空白。同時(shí)用青霉素鈉對(duì)照品同法測(cè)定作對(duì)照，算出供試品的含量。V樣空V樣對(duì)照液+緩沖液+碘液+回滴+堿+酸+緩沖液+碘液+回滴V對(duì)空V對(duì)2.方法供試液+緩沖液+碘液+回滴+堿+酸+緩沖液+碘液+回滴空白試驗(yàn)A、消除樣品已降解產(chǎn)物的干擾B、消除樣品中其他消耗碘的雜質(zhì)的干擾C、消除碘揮發(fā)造成的誤差以未經(jīng)水解的樣品作空白測(cè)定空白樣品I2Na2S2O3I-I2采用標(biāo)準(zhǔn)品平行對(duì)照測(cè)定A、可消除溫度、pH、操作、環(huán)境等條件的影響B(tài)、使本法測(cè)定結(jié)果與微生物檢定法一致3.條件（1）弱酸性pH4.5堿↑I2→IO3-+I-酸↑普魯卡因與碘在酸性條件下會(huì)產(chǎn)生復(fù)鹽沉淀（2）溫度24～26℃溫度＞38℃未水解的供試品亦消耗碘（3）水解時(shí)間以水解20分鐘后的耗碘量最大（4）反應(yīng)時(shí)間反應(yīng)20分鐘后，耗碘量隨時(shí)間的變化較小，可減小含量測(cè)定的誤差。4.特點(diǎn)（1）靈敏度高樣品:碘=1:8（2）反應(yīng)條件、實(shí)驗(yàn)操作要求高V對(duì)、V對(duì)空V樣、V樣空1份含量加試劑次序、反應(yīng)時(shí)間、滴定速度相同4I2→8I-5.計(jì)算原料

（二）汞量法（電位配位滴定法)1.原理（水解）青霉素族ChP2.方法醋酸鹽緩沖液pH4.6滴定水解pH4.6滴定樣品以未經(jīng)水解的樣品作空白測(cè)定例青霉素鈉含量測(cè)定取本品約50mg，精密稱定，加水5ml溶解后，加1mol/L氫氧化鈉溶液5ml，搖勻，放置15分鐘，加1mol/L硝酸溶液5ml，醋酸鹽緩沖液(pH4.6)20ml及水20ml，搖勻，照電位滴定法(附錄ⅦA),用鉑電極為指示電極，汞-硫酸亞汞電極為參比電極，在35～40℃，用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)緩慢滴定，（控制滴定過(guò)程約為15分鐘），不計(jì)第一個(gè)等當(dāng)點(diǎn)，計(jì)算第二個(gè)等當(dāng)點(diǎn)時(shí)消耗滴定液的量。每1ml硝酸汞滴定液(0.02mol/L)相當(dāng)于7.128mg的總青霉素(按C16H17N2NaO4S計(jì)算)。另取本品約0.5g，精密稱定，加水與上述醋酸鹽緩沖液各25ml，振搖使完全溶解，在室溫下，立即用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)滴定，終點(diǎn)判斷方法同上.每1ml硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相當(dāng)于7.128mg的降解物（按C16H17N2NaO4S計(jì)算）?？偳嗝顾氐陌俜趾颗c降解物的百分含量之差值即為青霉素的含量。3、討論（1）以第二次滴定突躍為終點(diǎn)電位法指示終點(diǎn)（2）反應(yīng)摩爾比

1:1（3）空白試驗(yàn)消除已降解產(chǎn)物干擾（4）優(yōu)點(diǎn)

不需標(biāo)準(zhǔn)品4、計(jì)算精密稱取含水量為0.5%的青霉素鈉0.0502g，按藥典方法測(cè)定總青霉素含量時(shí)，用去硝酸汞滴定液(0.02009mol/L)6.97ml。另精密稱取上述樣品0.5013g，按藥典方法測(cè)定降解物含量時(shí)，用去硝酸汞滴定液(0.02009mol/L)1.33ml。以干燥品計(jì)算，求樣品中青霉素的含量。例青霉素鈉含量測(cè)定酸堿滴定法（三）1、原理△（鈉鹽）β-內(nèi)酰胺類ChP△2、方法△中和中和例苯唑西林鈉含量測(cè)定取本品約0.5g，精密稱定，加新沸過(guò)的并用0.01mol/L氫氧化鈉溶液中和至酚酞指示液剛顯紅色的水20ml，使溶解,再用0.01mol/L氫氧化鈉溶液中和后，精密加氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)25ml，搖勻，置水浴中加熱20分鐘，注意避免吸收空氣中的二氧化碳，冷卻后，加酚酞指示液1～2滴，用鹽酸滴定液（0.1mol/L）滴定，并將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1ml的氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于40.14mgC19H19N3O5S。3、討論（1）水解前先中和溶劑和樣品（2）加熱時(shí)避免吸收CO2△不能使酚酞變紅（3）空白試驗(yàn)校正(消除Na2CO3干擾)（4）特點(diǎn)簡(jiǎn)便快速不適用于有殘留酯的產(chǎn)品（水解）可見(jiàn)-紫外分光光度法（四）1、酸水解法（銅鹽法）（1）原理穩(wěn)定劑JP青霉素族（2）方法△（3）特點(diǎn)實(shí)驗(yàn)條件隨各藥物穩(wěn)定性不同而定標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照法（4）計(jì)算2、硫醇汞鹽法（1）原理（咪唑）青霉素族ChP咪唑（2）方法對(duì)照品法計(jì)算pH9例氨芐西林鈉含量測(cè)定取本品約60mg置100ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置另一100ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，再精密量取5ml，置25ml量瓶中，加硼酸緩沖液2.5ml與醋酐的乙腈溶液（1→50）0.25ml，放置5min后，加咪唑溶液至刻度，搖勻，置60℃水浴中，加熱30min，取出冷卻，照分光光度法（附錄ⅣA），在325nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度；另取氨芐西林三水合物標(biāo)準(zhǔn)品，按同法測(cè)定，計(jì)算，即得。

（3）討論a.咪唑催化的水解產(chǎn)率高，硫醇汞鹽穩(wěn)定（≥3h）b.側(cè)鏈有-NH2時(shí)，需加醋酐先將其乙?；蟛拍馨l(fā)生上述反應(yīng)pH9（4）特點(diǎn)A、簡(jiǎn)便快速B、用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，重現(xiàn)性良好，RSD≤1%3、羥肟酸比色法USPJPFe3+/3H+紅色β-內(nèi)酰胺類NaOHHPLC法（五）ChP頭孢菌素類內(nèi)標(biāo)法＋校正因子外標(biāo)法特點(diǎn)快速、高效、靈敏專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好

一法多用（鑒別、檢查、含測(cè)）哌拉西寧原料藥含量測(cè)定色譜條件用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇–0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液–10％氫氧化四乙基銨溶液–水（400︰50︰3︰547）用磷酸調(diào)節(jié)pH值至5.5為流動(dòng)相。檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。第三節(jié)氨基糖苷類抗生素鏈霉素雙氫鏈霉素新霉素卡那霉素慶大霉素巴龍霉素鏈霉素鏈霉胍+鏈霉糖+N-甲基-L-葡萄糖胺

苷元糖鏈霉雙糖胺鏈霉胍鏈霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺鏈霉胍鏈霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺慶大霉素

糖苷元絳紅糖胺+脫氧鏈霉胺+加洛糖胺

糖絳紅糖胺紫素胺2-脫氧鏈霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺絳紅糖胺紫素胺2-脫氧鏈霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺慶大霉素C復(fù)合物慶大霉素C1R=HR1、R2=CH3慶大霉素C2R=R2=H

R1=CH3慶大霉素C1aR、R1、R2=H慶大霉素C2aR=CH3R1=R2=H

慶大霉素C2bR=R1=HR2=CH3一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)多與硫酸成鹽鏈霉素3個(gè)慶大霉素5個(gè)堿性中心堿性（一）水溶性溶解性（二）鏈霉素pH5～7.5慶大霉素pH2～12穩(wěn)定UV（三）穩(wěn)定性（四）鏈霉素水解產(chǎn)物反應(yīng)（五）坂口反應(yīng)N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)麥芽酚反應(yīng)二、鑒別茚三酮反應(yīng)（一）△羥基胺結(jié)構(gòu)N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)（二）乙酰丙酮OH-吡咯衍生物對(duì)二甲氨基苯甲醛H+紅色（Elson-Morgan反應(yīng)）(縮合)紅色對(duì)二甲氨基苯甲醛H+麥芽酚反應(yīng)（三）

鏈霉糖特有反應(yīng)H+分子重排紫紅麥芽酚鏈霉胍特有反應(yīng)（或α-萘酚）8-羥基喹啉坂口反應(yīng)（四）α-萘酚（四）反應(yīng)H+UV法（五）IR法（六）慶大霉素?zé)oUV吸收TLC法（七）三、檢查鏈霉素雜質(zhì)（一）鏈霉素B（甘露糖鏈霉素）方法TLC中的對(duì)照品法（BP）1.來(lái)源反應(yīng)中間體對(duì)微生物的活性無(wú)明顯差異毒副作用和耐藥性不同發(fā)酵菌種不同工藝差別C組分比例不一致規(guī)定控制各組分的相對(duì)百分含量ChPUSPBPJP慶大霉素C組分的測(cè)定（二）λmax=330nm衍生化原理1.1-烷基硫代-2-烷基異吲哚衍生物RP－HPLC方法2.規(guī)定C125~50%C1a15~40%C2a+C220~50%計(jì)算3.峰面積歸一化法三、含量測(cè)定鏈霉素、慶大霉素微生物檢定法本法系利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散作用量反應(yīng)平行線原理的設(shè)計(jì)，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品兩者對(duì)接種的試驗(yàn)菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，以測(cè)定供試品效價(jià)的一種方法。四、血清中慶大霉素的HPLC法血漿樣品的預(yù)處理離子對(duì)色譜法的目的：除去氨基酸、