第二章 細胞反應過程動力學

第二章細胞反應動力學2.1微生物反應過程概論2.1.1微生物反應過程主要特征（1）微生物是該反應過程的主體（2）微生物反應的本質是復雜的酶催化反應體系（3）微生物反應是非常復雜的反應過程復雜性表現(xiàn)代謝成網絡化分布，并相互影響，無法完全了解清楚反應體系中的細胞生長、基質消耗和產物生成，三者的動力學規(guī)律既有聯(lián)系，又有明顯差別，且有各自的最佳反應條件。時變性強，非線性無法準確計量、定量5.多相：氣相、液相和固相多組分：培養(yǎng)基中多種營養(yǎng)成分，多種代謝產物，細胞內也具有不同生理功能的大、中、小分子化合物。復雜的群體性：同時存在不同生理特性、不同活力的細胞群體。與酶反應比較催化劑酶微生物(細胞)反應類型單一，高度選擇性復雜，由一系列生化反應組成有效催化劑濃度不增殖一般增殖催化劑穩(wěn)定性失活衰老、菌種退化、質粒丟失底物單一，有時需輔酶各種營養(yǎng)物質、前體物質，自身具備輔酶再生及能量供應體系副產物少，較易純化多，純化困難供氧不重要對耗氧菌很重要2.1.2微生物反應動力學的描述方法微生物反應動力學包括細胞生長動力學、反應基質消耗動力學和代謝產物生成動力學，其中細胞生長動力學是其核心。為了描述細胞培養(yǎng)過程的細胞質量、底物質量、產物質量的變化關系，在細胞反應動力學中用細胞反應的速率、細胞反應的比速率、細胞反應的得率等來描述。其定義分別如下：（1）細胞反應的速率表示為單位反應體積、單位時間內的某一組分的量的變化。在細胞反應中主要的反應的速率有：

①細胞生長速率式中CX——細胞濃度，（g/L）

t——時間，（h）細胞濃度通常用單位體積的培養(yǎng)液中的細胞（或菌體）的干燥質量表示。細胞濃度一般用質量單位表示，很難用摩爾單位表示。

②底物消耗速率式中CS——底物濃度，（g/L）或（mol/L）③氧消耗速率式中CO——單位體積的培養(yǎng)液中O2的消耗量，（g/L）或（mol/L）④產物生成速率式中CP——產物濃度，（g/L）或（mol/L）⑤CO2生成速率式中CCO2——單位體積的培養(yǎng)液中CO2生成量，（g/L）或（mol/L）⑥熱量的生成速率式中CH——單位體積的培養(yǎng)液中熱量的生成量，（kJ/L）（2）細胞反應的比速率：單位時間內單位菌體消耗基質或形成產物（菌體）的量稱為比速，是生物反應中用于描述反應速度的常用概念（不同反應間的對比，消除細胞量的效應）在細胞反應中主要的反應的比速率有：①細胞的比生長速率（1/h）

②底物的比消耗速率

（1/h）或（mol/g·h）

③氧的比消耗速率

（1/h）或（mol/g·h）

④產物的比生成速率

（1/h）或（mol/g·h）⑤CO2的比生成速率

（1/h）或（mol/g·h）⑥熱量的比生成速率

（kJ/g·h）（3）細胞反應的得率①細胞對底物的得率

在間歇的培養(yǎng)過程中的細胞對底物的得率一般是隨著培養(yǎng)時間而變化的，即因隨著培養(yǎng)的進行培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分的組成、細胞的活性是變化的，所以瞬時的細胞對底物的得率可表示為

間歇培養(yǎng)的細胞對底物的總得率

②細胞對氧的得率在間歇的培養(yǎng)過程中的細胞對氧的瞬時得率為

③產物對底物的得率在間歇的培養(yǎng)過程中的產物對底物的瞬時得率為④生成的熱量對底物的得率在間歇的培養(yǎng)過程中生成的熱量對底物的瞬時得率為2.2細胞反應計量學反應計量學是對反應物系的組成或反應的程度的量化的研究。通過反應計量學可以得到反應組成分的數量關系及變化規(guī)律。

反應計量學反應工程學的理論基礎反應熱力學反應動力學微生物細胞化學組成的主要物質為C、H、O、N，及P、S、K、Na等?？蓪⒓毎砸话愕幕瘜W物質的表達形式寫作C

H

O

N

。典型的微生物細胞的組成為CH1.8O0.5N0.2。例如大腸桿菌細胞的化學組成（以干基計%）成分含量成分含量CHONPSK5020814311NaCaMgClFe其他10.50.50.50.20.32.2.1忽略產物生成的細胞生長過程的計量關系對忽略產物生成的細胞生長過程的計量關系可表示為CmHnOl+aO2+bNH3

cC

H

O

N

+dCO2+eH2O底物碳源氮源細胞對C元素：（1）對H元素：（2）對O元素：（3）對N元素：（4）上述4個細胞反應的計量方程，不足以計算a、b、c、d、e等5個未知量，因而再尋找1個方程，如在好氧型培養(yǎng)時，可定義呼吸商作為第5個方程（5）聯(lián)立1～5式，有解得細胞反應方程的a、b、c、d、e等5個系數2.2.2細胞反應的化學平衡通式底物用于轉化為細胞的化學平衡式為aCmHnOl+bO2+cNH3=dC

H

O

N

+eH2O+fCO2

底物細胞（1）底物用于轉化為產物的化學平衡式為a’CmHnOl+b’O2+c’NH3=d’C’H’O’N’+e’H2O+f’CO2產物（2）將a/a’乘（2）式有aCmHnOl+(ab’/a’)O2+(ac’/a’)NH3=

(ad’/a’)

C’H’O’N’+(ae’/a’)

H2O+(af’/a’)CO2（3）以F表示底物轉化為產物的分率，則(1-F)為底物轉化為細胞的分率，用F乘（3）式有FaCmHnOl+(Fab’/a’)O2+(Fac’/a’)NH3=(Fad’/a’)

C’H’O’N’+(Fae’/a’)

H2O+(Faf’/a’)CO2（4）用(1-F)乘（1）式有(1-F)aCmHnOl+(1-F)

bO2+(1-F)

cNH3=(1-F)

dC

H

O

N

+(1-F)

eH2O+(1-F)

fCO2（5）（4）式與（5）式相加，有aCmHnOl+{b-F[

(a’b-ab’)/a’

]}O2+{c-F[

(a’c-ac’)/a’

]}NH3=(Fad’/a’)

C’H’O’N’+d

(1-F)C

H

O

N

+{e-F[

(a’e-ae’)/a’

]}H2O+{b-F[

(a’f-af’)/a’

]}CO2_——細胞反應的化學平衡通式2.3細胞反應的碳平衡2.3.1細胞反應的碳元素平衡對細胞的反應過程的底物（S）、產物（P）、細胞（X）和CO2之間可建立其碳元素平衡關系。

或式中qS—底物的比消耗速率，(mol/g·h)

—細胞的比生長速率，(1/h)

qCO2—CO2的比生成速率，(mol/g·h)qP—產物的比生成速率，(mol/g·h)

1—1mol底物中的碳元素的含量（g/mol），例如葡萄糖為底物時

1=72(g/molglucose)；

2—1g細胞中的碳元素的含量（g/g），一般

2≈0.5(gC/gbiomass)；

3—1molCO2中的碳元素的含量（g/mol），

3=12(g/molCO2)；

4—1mol產物中的碳元素的含量（g/mol）例如產物為乙醇時

4=24(gC/molethanol)；產物為乙酸時

4=24(gC/molaceticacid)；產物為乳醇時

4=36(gC/mollacticacid)；2.3.2細胞反應的碳源平衡對細胞反應，底物的消耗（??CS）可由如下項組成滿足于細胞生長所需的碳源底物消耗(??CS)G細胞維持的碳源底物的消耗(??CS)m生成產物的碳源底物的消耗(??CS)P即

或引入細胞對底物的得率及產物對底物的得率的概念，有：或其中YX/Smax——細胞對底物的理論得率，

YP/Smax——產物對底物的理論得率，YX/Smax的意義為用于同化為細胞的碳源底物消耗所得到的細胞的得率，即稱之為“細胞對底物的理論得率”或“細胞對底物的最大得率”。表示細胞對底物得率的最大的可能性。YX/Smax與YX/S的單位為g/mol或g/(L·h)]/[mol/(L·h)]。YP/Smax的意義為用于異化為產物的碳源底物消耗所得到的產物的得率，即稱之為“產物對底物的理論得率”或“產物對底物的最大得率”。表示產物對底物得率的最大的可能性。YP/Smax與YP/S的區(qū)別在于YX/Smax與YX/S的區(qū)別在于在以培養(yǎng)細胞為目的的細胞反應的過程中，代謝產物的積累可忽略不計的情況下，有上式為qS關于μ的直線方程，可通過這一直線方程求取YX/Smax和m。將上式改寫，有

即是1/YX/S關于1/μ的線性方程，截距為1/YX/Smax，斜率為m。

2.4細胞反應的ATP的平衡經典的生物化學指出：在有氧條件下TCA循環(huán)葡萄糖+38ADPCO2+H2O+38ATP在嫌氣條件下酵解途經葡萄糖+2ADP乳酸+2ATP細胞對ATP的得率YX/ATP一般底物為供能的限制性底物時,在厭氧條件下

YX/ATP≈10(gbiomass/molATP)能量生長的偶聯(lián)型與非偶聯(lián)型細胞的生長過程依靠ATP的高能鍵釋放的能量將細胞的構成材料合成為細胞的高分子物質（如蛋白質、DNA、RNA、脂類、多糖等）能量生長的偶聯(lián)型當有大量的細胞構成材料時，細胞的生長取決于ATP的供能，這種生長為能量生長的偶聯(lián)型。能量生長的非偶聯(lián)型當缺少細胞構成材料或細胞生長受抑制時，細胞的生長取決于細胞構成材料的供給，這時多余的ATP的高能鍵會被酶分解，能量以廢熱釋放，這種生長為能量生長的非偶聯(lián)型。此時YX/ATP<10(gbiomass/molATP)2.5細胞反應的能量平衡通過對細胞反應的能量平衡來確定在反應過程中的能量的相對利用有機物的氧化焓變和有效電子轉移微生物細胞利用碳源的分解過程所釋放的能量，通過ATP等貯能物質，獲得自身生長的能量。所有物質的氧化總是伴隨著電子轉移，物質在氧化過程中，每個氧氣分子可以接受4個電子，將物質在氧化過程中伴隨著能量釋放所進行的電子轉移稱為有效電子轉移。例如H2+0.5O2→H2O△H=－241.4kJ/mol其有效電子轉移數為2，記作2(ave

－)。

葡萄糖完全氧化的反應

C6H12O6+6O2→6CO2+6H2O

其有效電子轉移數為6×4=24(ave

－/mol)。

大量的試驗表明，有機化合物的氧化時，每轉移1個有效電子，平均釋放111kJ的熱量，記作△Have－

=－111kJ/ave

－例如葡萄糖完全氧化的反應以有效電子轉移計算的釋放的能量為

△H葡萄糖*=(－111)×24=－2664kJ/mol用測熱計測定的葡萄糖燃燒過程得到的是

△H葡萄糖=－2813kJ/mol△H葡萄糖*與△H葡萄糖相差不到6%，這樣的誤差在工程上是可以接受的用有效電子轉移計算有機物所釋放的能量，在工程上十分方便。?！鱄——實際反應的焓變△H*——以有效電子轉移為基準的反應的焓變

在單一碳源的細胞培養(yǎng)過程中以焓變表達的能量平衡式為式中△HS*，△HX*，△HP*，——

以有效電子轉移為基準的碳源底物、細胞、產物氧化的焓變

△HX

=－22.15kJ/gbiomass，當僅考慮細胞的C、H、O、N等組分時，以有效電子轉移為基準的細胞氧化的焓變△HX*=－18.6kJ/gbiomass。細胞反應過程的通風與反應熱好氧發(fā)酵中，當產物只有CO2時細胞反應過程的通風量與反應熱之間的關系式為上式可寫作式中qQ——

細胞反應過程的反應熱比生成速率

qO

——

細胞反應過程的比耗氧速率△HO*——

細胞呼吸（耗氧）反應的焓變△HO

=

K=

-444kJ/mol=0.444kJ/mmol，對實際的反應試驗得設計反應器的冷卻面積和冷卻水用量的依據判斷供氧的狀況：當通風不足時會≥研究反應速度及其影響因素并建立反應速度與影響因素的關聯(lián)反應動力學模型反應器特性+反應器的操作模型操作條件與反應結果的關系，定量地控制反應過程發(fā)酵反應動力學的研究內容模型的簡化模型描述的是細胞群體動力學行為均一細胞模型(細胞間無差別)

確定論(非分離)模型與概率論(分離)模型3.細胞組成均一化結構模型與非結構模型均衡生長與非均衡生長4.反應體系均相化（游離細胞）分離化與均一化模型結構模型動力學模型的簡化細胞間無差異；各細胞均一；細胞由多組分組成各細胞生長不均一；不考慮細胞內的結構。平均細胞的近似平均細胞的近似均衡生長均衡生長非結構模型最理想的情況：不考慮細胞內的結構；細胞間無差異，各細胞均一；細胞群體作為一種溶質。實際情況：細胞由多組分組成；各細胞生長不均一；確定論模型

概率論模型

分批培養(yǎng)中微生物的生長遲滯期對數生長期穩(wěn)定期死亡期當細胞內的與細胞分裂相關的物質濃度達到一定程度，細胞開始分裂，這時細胞生長很快，比生長速率幾近常數。這個時期稱為對數生長期。在對數生長期內的微生物細胞的生長速率為以t=0，CX=CX0，t=t，CX=CX為邊界條件對上式積分，有定義為微生物培養(yǎng)的倍增時間2.5細胞生長動力學

無抑制的細胞生長動力學模型－Monod方程模型假定：均衡生長，濃度為唯一變量不考慮細胞間的差別，對細胞群體的動力學行為進行描述只有一種限制性基質單一反應，一步限速反應，細胞得率為一常數適用于對數期和減速期，是經驗模型Ks為飽和常數，其值等于μ為μm一半時的限制性底物濃度注意：Ks數量級當底物濃度CS遠小于飽和常數KS時，Monod方程可簡化為此時的細胞生長速率為關于底物濃度的一級動力學關系當底物濃度CS遠大于飽和常數KS時，Monod方程可簡化為

此時的細胞生長速率為關于底物濃度的零級動力學關系初始底物濃度過高時雙底物限制高濃度的底物的抑制的作用細胞反應的比生長速率與底物濃度的關系為令得產物抑制延遲期動力學tL－－延遲期的總時間穩(wěn)定期動力學對數死亡模型影響比死亡速率kd的因素活化能：與微生物種類有關溫度培養(yǎng)基成分的受熱破壞也可看做一級反應其kd也遵循阿累尼烏斯方程活化能大的反應,其反應速度隨溫度的變化也大，反之亦然。對培養(yǎng)基滅菌過程培養(yǎng)基中雜菌細胞的受熱死亡培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的受熱損失

受熱物質

(J/mol)維生素B12維生素B1鹽酸鹽嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子肉瘤梭桿菌枯草桿菌孢子9623292048283257343088317984高溫快速滅菌原理其它致死模型：循序死亡模型2.6底物消耗動力學物質流：合成新的細胞物質合成胞外物質能量流：進行胞內反應進行胞外物質合成反應維持胞內外濃度梯度2.6.1.當細胞反應過程消耗的底物僅用于生長細胞，底物濃度的變化與細胞濃度變化可關聯(lián)為當底物消耗只用于細胞生長時有若CX0很小可忽略，則上式可簡化為

當反應開始時，CX值相對較低，此時提高CX值，有利于其生長速率的提高；當反應后期，CX值較高，而相應CS值很低，此時若繼續(xù)提高CX值，則其生長速率繼續(xù)下降，rX有一個最大值。rX—CX關系曲線氧的消耗動力學2.6.2包括維持代謝的底物消耗動力學對于在熱力學意義上的遠離平衡態(tài)的活細胞，為了維持其活性，需要獲取高能物質并將其化學能轉化為熱能，以維持細胞的滲透壓、修復DNA、RNA和其他大分子物質，因此能量消耗不僅是用于細胞生長上，同時也用于細胞的維持上。提供細胞反應的能量的來源是以碳源為底物的物質，則底物的消耗速率可表示為

式中m—