虎斑麝香卵群胚胎發(fā)育的顯微觀察

虎斑麝香卵群胚胎發(fā)育的顯微觀察

胡里甘是1831年屬于軟體動(dòng)物科的一個(gè)。這是一個(gè)?；邽踬\為經(jīng)濟(jì)頭足類(lèi),胴體長(zhǎng)可達(dá)42cm,體重5kg,主要分布于南海、菲律賓群島、馬來(lái)群島、印度近海以及紅海等海域,較著名的漁場(chǎng)有南海漁場(chǎng)、印度沿岸漁場(chǎng)以及亞丁灣漁場(chǎng)(董正之,1988)?；邽踬\在廣東、海南沿岸產(chǎn)卵期為3—5月,產(chǎn)卵期的水溫范圍為18—24℃,產(chǎn)卵場(chǎng)水深為5—20m(董正之,1991)。成體在生殖季節(jié)中趨光性明顯,不同海域中的生長(zhǎng)速度有較大的差異。在繁殖期間,雄體背面的“虎斑”特別鮮明,即“婚姻色”,有追偶、爭(zhēng)偶等復(fù)雜的交配行為。20世紀(jì)80年代以來(lái),國(guó)內(nèi)外已相繼開(kāi)展了關(guān)于虎斑烏賊形態(tài)特征、地理分布、生物學(xué)特性等方面研究(Boletzky,1988,2003;董正之,1991;Nabhitabhata,1995;Nabhitabhataetal,1999;Minton,2004;Mintonetal,2001),鄭小東等(2009)詳細(xì)介紹了虎斑烏賊等頭足類(lèi)的繁殖策略。目前,虎斑烏賊在泰國(guó)已具商業(yè)化養(yǎng)殖規(guī)模,我國(guó)則主要是采用槍刺、拖網(wǎng)和誘導(dǎo)的方式來(lái)捕獲(陳新軍等,2009)。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)在室內(nèi)培育虎斑烏賊受精卵,獲取不同發(fā)育時(shí)期的胚胎,闡述其胚胎發(fā)育過(guò)程,并探討眼、腕等主要器官的發(fā)生和變化過(guò)程,旨在豐富虎斑烏賊繁殖生物學(xué)資料,為其在我國(guó)的增養(yǎng)殖提供相關(guān)理論支撐。1材料和方法1.1紅酵母樹(shù)的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)所用虎斑烏賊(Sepiapharaonis)受精卵分別于2008年3月采自海南省文昌市,2010年4月采自廣東省湛江市遂溪縣江洪鎮(zhèn)養(yǎng)殖基地。1.2胚胎特征測(cè)定虎斑烏賊受精卵經(jīng)室內(nèi)培育,定時(shí)獲取發(fā)育各時(shí)期的胚胎,用固定液(10%Formalin或Bouin’s液)固定保存。將固定樣品置于解剖鏡下觀察記錄胚胎特征,顯微拍照后進(jìn)行分析?；邽踬\產(chǎn)卵后2d,每2h隨機(jī)觀察10—15粒受精卵,2d后每天采集10—15粒受精卵。用鑷子將卵柄夾住,輕輕撕開(kāi)外層卵膜,取出胚胎,操作時(shí)避免損壞胚體或卵黃。測(cè)量胚胎長(zhǎng)度、卵黃直徑、初孵幼體全長(zhǎng)、胴體長(zhǎng)和重量。統(tǒng)計(jì)烏賊孵化時(shí)間和孵化率。2結(jié)果2.1卵膜及天麻層數(shù)的變化雌烏賊聚集一起產(chǎn)卵,單粒產(chǎn)出,卵粒一端突出,另一端具有分叉的柄,粘附在附著基上,卵粒粘在一起成葡萄狀(圖1a)。卵呈檸檬狀,奶油色(圖1b),表面光滑,半透明狀,有彈性,內(nèi)部卵黃可見(jiàn)?；邽踬\卵長(zhǎng)徑(30.7±2.4)mm,短徑(13.4±1.3)mm(觀察的標(biāo)本數(shù)N>100)。剛產(chǎn)出的卵具三級(jí)卵膜,隨著發(fā)育的進(jìn)行,卵子逐漸緊縮,后又逐漸膨大,到即將孵出時(shí),體積脹大到原來(lái)的2—2.5倍。胚胎長(zhǎng)短徑變化趨勢(shì)為:大(26mm×16mm)→小(21.5mm×11mm)→大(25.5mm×16.5mm)(表1)。卵膜的同心層數(shù)根據(jù)其發(fā)育進(jìn)程的不同而不同。發(fā)育進(jìn)程慢的卵,卵膜同心層數(shù)多,最內(nèi)層卵膜與卵黃膜間的粘液性強(qiáng);而發(fā)育進(jìn)程快的卵,卵膜同心層數(shù)少,最內(nèi)層卵膜與卵黃膜間的粘液大量減少,以至消失。初產(chǎn)的受精卵的卵黃近似橢圓形(一端大,一端小),結(jié)實(shí),動(dòng)物極在小端,隨著孵化時(shí)間的延長(zhǎng),卵黃明顯變大且松散,含許多顆粒狀的滴狀物,難溶于水。外腕、鰭、漏斗等器官形成之后,可見(jiàn)卵膜明顯脹大,直到孵化前為止。2.2原腸組織結(jié)構(gòu)變化根據(jù)Boletzky(2003)對(duì)烏賊胚胎分期,將虎斑烏賊的胚胎發(fā)育分為30個(gè)時(shí)期,各期特征以及相關(guān)圖片如下:1期:剛產(chǎn)受精卵,透明而略帶奶油色,橢圓形,較尖的一端為動(dòng)物極。卵膜外尚有初級(jí)卵膜,其外還有較厚的三級(jí)卵膜。剛產(chǎn)出的卵子松軟,外面常粘附沙質(zhì)(圖1b)。2期:動(dòng)物極開(kāi)始卵裂,卵裂僅在卵黃表面的一端進(jìn)行,卵裂方式為不完全卵裂的盤(pán)狀卵裂。各個(gè)細(xì)胞期明顯,第一次卵裂形成2個(gè)分裂球,一條分裂溝(圖1c),第二次卵裂溝與第一次卵裂溝垂直,形成4個(gè)分裂球(圖1d)。1d后進(jìn)入多細(xì)胞期,中央細(xì)胞小,邊緣細(xì)胞大,邊緣卵裂溝較多且呈輻射狀。在4細(xì)胞期和32細(xì)胞期中,存在環(huán)形分割和輻射分割等不同方式,其所造成的分割球大小和數(shù)目均不同(圖1e)。3期:2d后發(fā)育到囊胚期,在胚盤(pán)處形成一層囊胚,細(xì)胞數(shù)量明顯增多,細(xì)胞體積變小,中央為明區(qū),邊緣為暗區(qū),隨著分裂的繼續(xù),細(xì)胞界限越來(lái)越不清晰,囊胚層邊緣細(xì)胞開(kāi)始向植物極下包。胚胎邊緣細(xì)胞內(nèi)卷而逐漸加厚,下包卵子比例接近1:8(圖1f)。4期:3d后進(jìn)入原腸早期,囊胚層邊緣細(xì)胞繼續(xù)分裂,從四周向植物極延伸而下包,逐漸將卵黃包在內(nèi)部,將形成卵黃囊。卵黃膜下包卵子比例1:4(圖1g)。5期:5d處于原腸晚期,胚盤(pán)處有不規(guī)則的隆起,形成深淺不一的溝,開(kāi)始出現(xiàn)腕突起,觸腕突起,視環(huán)突起(圖1h)。卵黃膜下包卵子比例1:2,其他器官芽相繼出現(xiàn)。按照下包比例,分為6—8期。6期:卵黃膜下包卵子比例3:5。9期:外器官芽處于發(fā)育階段,眼、漏斗、鰓、腕、平衡囊等原基出現(xiàn)(圖1i)。10期:胚體開(kāi)始從卵黃囊上向外突出,卵黃囊和胚體通過(guò)食道相連,外套膜、漏斗、口、腕、平衡囊等結(jié)構(gòu)顯露(圖1j)。11期:眼明顯,眼柄發(fā)達(dá)。胚胎與卵黃體積比增大,出現(xiàn)兩個(gè)芽狀的肉鰭。12—15期:胚體頭部結(jié)構(gòu)復(fù)雜化,晶體輪廓出現(xiàn),胴體形成。卵黃囊體積縮小,胚體與卵黃囊長(zhǎng)度比為0.34:1(圖1k)。16期:胚胎清晰可辨,頭部與胴體連接處(內(nèi)、外卵黃囊分界處)向內(nèi)凹陷,腕明顯,無(wú)吸盤(pán)(圖1l)。17—23期:出現(xiàn)漏斗褶,漏斗形成(圖2a)。眼由無(wú)色變?yōu)闇\紅色,腕較前期增長(zhǎng)(圖2b)。24期:眼柄縮短,紅色眼形成,虹膜呈一顯著的紅色圓圈,外有一層透明膜;漏斗具開(kāi)口(圖2c);平衡囊內(nèi)平衡石清晰可見(jiàn),腕末端鈍圓,外套膜在腹面游離。25期:海螵蛸開(kāi)始生長(zhǎng),眼紅色(圖2c),胴體出現(xiàn)淡黃色色素顆粒,色素斑在每條腕基部、兩平衡石上方膜上出現(xiàn),在胴體部上呈現(xiàn)均勻分布,呈橙紅色(圖2d);腕末端尖細(xì),腕具吸盤(pán)。胚體與卵黃囊長(zhǎng)度比為0.45:1。26期:墨囊內(nèi)有墨汁,色素斑在每條腕基部各有兩個(gè),平衡石上方色素斑變大,在胴體部背面規(guī)則分布,顏色加深。外部卵黃囊進(jìn)一步縮小(圖2e)。27期:黑色眼形成,鰭顯著,胴體背面色素斑數(shù)目增多,卵膜內(nèi)卵柄端空間變小。28期:眼黑色,主眼瞼完全覆蓋了視囊泡,且一部分轉(zhuǎn)變成透明的角膜。胴體色素顆粒增多。卵黃囊進(jìn)一步縮小,胚體與卵黃囊長(zhǎng)度比為0.76:1(圖2f)。29期:胴體腹部斑點(diǎn)由淡黃色轉(zhuǎn)變成黑色,鰭分化且在尾端分開(kāi),尾端可見(jiàn)骨針(圖2g、h);胴體背部海螵鞘明顯隆起(圖2i),具較密的條斑紋(圖2j),胚體與卵黃囊長(zhǎng)度比為2.51:1。30期:形態(tài)結(jié)構(gòu)與成體基本相似,心臟跳動(dòng)約12次/min。胚胎在孵化前已能在卵膜中輕微活動(dòng),幼體怕強(qiáng)光,若受刺激,墨囊中的墨汁會(huì)噴到卵膜內(nèi)。孵出前胚體用胴體的頂部頂撞卵膜,卵膜變得薄而透明,然后破膜而出(圖2k)。初孵幼體觸腕明顯長(zhǎng)于其他腕,每條腕上具4列吸盤(pán)(圖2l)。2.3胚體及卵黃長(zhǎng)度在胚體生長(zhǎng)期間,胚體長(zhǎng)度隨時(shí)間逐漸增加,而卵黃大小則隨之減小,從7d至20d,胚體長(zhǎng)度由2.5mm增至11.3mm,而卵黃直徑由8.9mm減至4.5mm,胚體與卵黃長(zhǎng)度比例由0.28增至2.51(表2)。2.4虎斑浚大、底、粒卵不同的胚性卵體孵化如表3所示,受精卵在孵化水溫為(23±0.5)℃,鹽度28,pH7.41左右下孵化,經(jīng)過(guò)14—31d幼體陸續(xù)破膜孵出,虎斑烏賊的胚胎發(fā)育速度差別很大,在本實(shí)驗(yàn)條件下3500粒卵共孵出烏賊2985只,孵化率達(dá)85.3%。孵出幼體高峰期為20—24d,此期間共孵出幼體2471只,占總孵化量的82.8%。3討論3.1不同大小虎斑浚魚(yú)卵膜的發(fā)育虎斑烏賊卵單個(gè)、呈檸檬狀,多則聚集成串狀葡萄,卵膜白色,表面光滑、半透明狀,有彈性,長(zhǎng)徑(30.7±2.4)mm,短徑(13.4±1.3)mm。金烏賊雌體懷卵量一般800—2000粒,孵化前的卵膜脹大,長(zhǎng)徑約16—21mm,短徑約12—14mm,略呈葡萄狀,卵膜接近奶油色,半透明(王如才等,2008)?；邽踬\卵較曼氏無(wú)針烏賊(劉振勇等,2009)、金烏賊的卵大,可能與體型大有關(guān)。在虎斑烏賊胚胎發(fā)育過(guò)程中,卵膜經(jīng)歷一個(gè)柔軟—定形—縮小—膨大的變化過(guò)程,在卵子產(chǎn)出第3天卵子開(kāi)始收縮,到第7天收縮到最小,以后受精卵開(kāi)始膨大直至仔烏賊出膜。金烏賊、曼氏無(wú)針烏賊卵膜也經(jīng)歷了先縮小、再膨大的過(guò)程,曼氏無(wú)針烏賊卵到第8天收縮到最小(劉振勇等,2009);金烏賊卵子第3天卵膜開(kāi)始收縮,到第8天收縮到最小,約為產(chǎn)出時(shí)的2/5;而太平洋褶柔魚(yú)和中國(guó)槍烏賊卵膜只有膨大的過(guò)程,其原因可能與卵鞘有關(guān)(陳四清等,2010)。李嘉泳(1965)認(rèn)為卵膜縮到最低限度時(shí),同時(shí)也正是外部器官全部完成的時(shí)候。3.2金麻黃、金浚雜、曼氏無(wú)針麻黃發(fā)育不同時(shí)期的特征關(guān)于頭足類(lèi)動(dòng)物的胚胎發(fā)育過(guò)程,存在兩種劃分依據(jù):一是依據(jù)培育的天數(shù)劃分(李嘉泳,1965),二是依據(jù)器官的發(fā)生劃分(Boletzky,2003)。前者分類(lèi)方法受水溫、鹽度等實(shí)驗(yàn)條件的制約,因此未被廣泛采用。目前,我國(guó)關(guān)于烏賊繁殖生物學(xué)研究日漸增多(劉振勇等,2009;張建設(shè)等,2011;雷舒涵等,2011;陳四清等,2010),胚胎發(fā)育的時(shí)期也有不同劃分方法。例如,陳四清等(2010)將金烏賊胚胎發(fā)育過(guò)程劃分為5個(gè)典型時(shí)期,劉振勇等(2009)認(rèn)為曼氏無(wú)針烏賊發(fā)育歷經(jīng)7個(gè)時(shí)期。常抗美等(2009)描述曼氏無(wú)針烏賊胚胎發(fā)育經(jīng)過(guò)8個(gè)時(shí)期。金烏賊在眼的發(fā)育過(guò)程中經(jīng)歷從無(wú)色到紅色,再到黑色的過(guò)程(雷舒涵等,2011;陳四清等,2010)。本文參照Boletzky(2003)將虎斑烏賊胚胎發(fā)育過(guò)程劃分為30個(gè)時(shí)期,并對(duì)每個(gè)時(shí)期的特征進(jìn)行詳細(xì)描述。虎斑烏賊、金烏賊和曼氏無(wú)針烏賊外部器官發(fā)育過(guò)程比較見(jiàn)表4。初孵虎斑烏賊平均體長(zhǎng)(13.5±0.3)mm,平均胴體長(zhǎng)(8.6±0.3)mm,平均體重(0.18±0.02)g。剛孵出的金烏賊稚仔,胴長(zhǎng)約為5—6mm,外形與成體相近,能游動(dòng)和捕食,白天沉靜,夜間活躍(王如才等,2008)。曼氏無(wú)針烏賊初孵仔烏賊體長(zhǎng)(6.25±0.46)mm,胴體長(zhǎng)(3.72±0.34)mm;劉振勇等(2009)描述曼氏無(wú)針烏賊初孵仔烏賊體長(zhǎng)5.6mm,胴體長(zhǎng)3.4mm。Sepiaofficinalis初孵仔烏賊體重(0.102±0.018)g(BaezaRojanoetal,2010)。初孵虎斑烏賊是最大的,這與受精卵和親烏賊體型較大相一致。3.3溫度和孵化時(shí)間虎斑烏賊受精卵在孵化水溫(23±0.5)℃,鹽度28,pH7.41的條件下,孵化時(shí)間為14—31d,孵化高峰期為20—24d。曼氏無(wú)針烏賊在水溫為23.8—26.2℃、鹽度29.3、pH8.0—8.2時(shí),最快14d孵出幼體,最慢23d孵出幼體,孵出幼體高峰期為18—21d(劉振勇等,2009);在水溫23.5—24.2℃、鹽度25—28、pH8.0—8.2條件下18d孵出(?？姑赖?2009)。日本無(wú)針烏賊(與曼氏無(wú)針烏賊同種異名)在孵化水溫20—26℃,鹽度25.0—32.0條件下,受精卵經(jīng)17—26d破膜而出(鄭小東等,2010)。金烏賊在水溫16—23℃時(shí),孵化期約需1個(gè)