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文檔簡介

第十二章現(xiàn)代生物技術(shù)與家畜育種

學(xué)習(xí)要求:1.掌握生物技術(shù)的概念、了解其作用和意義2.掌握四種現(xiàn)代生物技術(shù)的原理及方法第一節(jié)生物技術(shù)的基本概況一、生物技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展

生物技術(shù)是應(yīng)用自然科學(xué)及工程學(xué)的原理,依靠微生物、動物、植物作反應(yīng)器將物料進(jìn)行加工,以提供產(chǎn)品來為社會服務(wù)的技術(shù)。二、動物育種技術(shù)及其發(fā)展現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展史上一些重要事件年表

ed三、動物育種中的現(xiàn)代生物技術(shù)2006年1月11日,美國科學(xué)家宣布培育出了世界上首只轉(zhuǎn)基因猴“安迪”,為人類最終戰(zhàn)勝糖尿病、乳腺病、帕金森氏癥和艾滋病等頑癥提供幫助。I’mAndy.轉(zhuǎn)基因斑馬魚,會在特別的光照下發(fā)出不同的光芒

胚胎移植第二節(jié)轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)

一、轉(zhuǎn)基因動物的概念

轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)是將外源DNA導(dǎo)入性細(xì)胞或胚胎細(xì)胞并生產(chǎn)出帶有外源DNA片段動物的一種技術(shù)。二、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的一般步驟

生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的步驟包括:

(1)選擇能有效表達(dá)的蛋白質(zhì);(2)克隆與分離編碼這些蛋白質(zhì)的基因;(3)選擇能與所需組織特異性表達(dá)方式相適應(yīng)的基因調(diào)節(jié)序列;(4)把調(diào)節(jié)序列與結(jié)構(gòu)基因重組拼接,并在培養(yǎng)細(xì)胞或小鼠中預(yù)先檢驗其表達(dá)情況;(5)把拼接的基因引入到受精卵的細(xì)胞核中;(6)把引入后的受精卵移植到子宮,完成胚胎發(fā)育;(7)檢測幼畜是否整合外源基因、外源基因的表達(dá)情況以及外源基因在其后代中的傳遞情況。部分后代細(xì)胞攜帶有轉(zhuǎn)入的外源基因,利用這些動物培育新的品系。三、導(dǎo)入基因的方法(一)顯微注射法(二)精子載體法(三)胚胎干細(xì)胞(ES)介導(dǎo)法(四)染色體片段顯微注入法(一)

人們已利用顯微注射法將胸苷激酶基因、生長激素基因和鼠myc基因轉(zhuǎn)入了哺乳動物細(xì)胞。這種方法不僅可以獲得轉(zhuǎn)基因動物所用的轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞,而且也可以通過哺乳動物細(xì)胞來生產(chǎn)有用的蛋白質(zhì)。(目前認(rèn)為胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、何杰金氏病及頭部腫瘤等都有myc基因的擴(kuò)增或過度表達(dá))

小鼠和兔的受精卵原核在普通顯微鏡下容易看到,而綿羊,尤其是豬和牛的卵細(xì)胞質(zhì)稠密,不能看到原核。Hammer等用干涉相差顯微鏡可觀察到80%的綿羊卵核,而豬和牛的卵子需經(jīng)離心處理再用干涉相差顯微鏡才能觀察到卵原核,離心處理后的多數(shù)受精卵仍能正常發(fā)育。(二)精子載體法方法:將成熟的精子與帶有外源DNA的載體進(jìn)行共培育之后,使精子有能力攜帶外源DNA進(jìn)入卵中,使之受精,并使外源DNA整合于染色體中。Bracet等(1971)將家兔精液和放射性標(biāo)記的SV40病毒DNA孵育后,在精子頭部能夠檢測到放射活性,病毒DNA在受精過程中被帶入了卵細(xì)胞。Lavitravo等(1989)把質(zhì)粒與小鼠的附睪精子共孵育30min,進(jìn)行體外授精和移植,結(jié)果獲得250個后代中,30%的為陽性,部分小鼠表達(dá)了CAT基因并傳到F1代。這一方法在轉(zhuǎn)基因鼠上的應(yīng)用使人們看到轉(zhuǎn)基因動物效率提高的希望。影響DNA與精子結(jié)合的因素可能是獲得成功的關(guān)鍵性因素,首先哺乳動物精子吸附外源DNA需特定的時期;其次精子吸附DNA時精子活性及DNA性質(zhì)都受影響。利用精子作為基因轉(zhuǎn)移的工具,在實踐中存在許多問題,但此技術(shù)至少在構(gòu)思上對于大動物轉(zhuǎn)基因研究具重要意義。(三)ES細(xì)胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell)是指當(dāng)受精卵分裂發(fā)育成囊胚時內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞,它具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性。無論在體外還是體內(nèi)環(huán)境,ES細(xì)胞都能被誘導(dǎo)分化為機(jī)體幾乎所有的細(xì)胞類型。胚胎干細(xì)胞注入寄主胚泡后,參與胚胎形成,進(jìn)入嵌合體動物的生殖系統(tǒng)。用DNA轉(zhuǎn)染法或反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法可將基因?qū)肱咛ジ杉?xì)胞,選出帶有目的基因的細(xì)胞克隆,然后導(dǎo)入受體胚胎。由此法生成的后代都是嵌合體,若由這些嵌合體胚胎中再分離出干細(xì)胞,用核移植技術(shù)將其細(xì)胞核植入無核卵細(xì)胞,這樣可以提高轉(zhuǎn)基因的效率。生物學(xué)中嵌合體是指同一個體中不同基因型的組織相互接觸而存在的現(xiàn)象。以噬菌體或病毒為載體的重組DNA分子引入受體細(xì)胞的過程

2007年3月24日英國《每日郵報》報道說,美國內(nèi)華達(dá)大學(xué)教授伊斯梅爾·贊賈尼歷經(jīng)7年研究,最終利用向綿羊胚胎注射人體干細(xì)胞的技術(shù),成功培育出一只含有15%人體細(xì)胞的綿羊??蒲腥藛T首先從人體骨髓中提取干細(xì)胞,然后將干細(xì)胞注入胎羊的腹膜中,這樣人體細(xì)胞就會通過新陳代謝和循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入胎羊體內(nèi)各個器官。羊羔降世兩個月后,就會長出含有人體細(xì)胞的肝、心臟、肺等器官。(四)染色體片段顯微注入法染色體介導(dǎo)法是指從人或動物染色體上割取特定的染色體片段(M期)或分離出來之后,以其為媒介將外源基因注入動物早期胚胎中,以獲得外源DNA的動物,嚴(yán)格地講稱為轉(zhuǎn)染色體動物。通常人們采用離心分離法或流式細(xì)胞儀(fowcytometry)分離法分離染色體。盡管目前該技術(shù)應(yīng)用困難較大,且成功率很低(0~0.002%),但由于它具有不需經(jīng)基因重組就可轉(zhuǎn)移超大型外源DNA(大于1000kb)之獨特優(yōu)點,適于多基因轉(zhuǎn)移。鑒于本法導(dǎo)入的遺傳信息片段長,能生產(chǎn)出具備某些特殊疾病的實驗動物模型。四、基因的選擇與轉(zhuǎn)基因動物的研究現(xiàn)狀1.轉(zhuǎn)入基因的選擇目前在動物轉(zhuǎn)基因的選擇上主要包括四大類:(1)與機(jī)體代謝調(diào)節(jié)有關(guān)的蛋白基因,這類基因參與機(jī)體組織生長發(fā)育的調(diào)節(jié),如生長激素基因等;(2)抗性基因;抗逆、抗病等;(3)經(jīng)濟(jì)性狀的主效基因,如豬和綿羊的高繁殖力基因、肉牛的“雙肌”基因等,這些基因與動物的生產(chǎn)力密切相關(guān);(4)治療人類疾病所需的蛋白質(zhì)基因,以拓寬動物的經(jīng)濟(jì)用途。提高動物生長、生產(chǎn)性能的研究

美國伊利諾斯大學(xué)研究出一種帶牛生長激素的轉(zhuǎn)基因豬,這種豬生長快,體大,飼料利用率高,可給養(yǎng)豬業(yè)帶來豐厚的經(jīng)濟(jì)效益。Bawden的研究小組1995年報道了成功地在轉(zhuǎn)基因小鼠和綿羊中表達(dá)了細(xì)胞半胱氨酸生物合成基因,以此嘗試改良羊毛的生長。半胱氨酸是羊毛合成的限制性氨基酸。1995年,BullockD.W.生產(chǎn)的轉(zhuǎn)類胰島素IGF-I的基因羊的羊毛產(chǎn)量得到了提高。1996年,新西蘭科學(xué)家Damak等將小鼠超高硫角蛋白啟動子與綿羊的IGF-IC13AJA融合基因顯微注入綿羊原核期胚胎,培育出的轉(zhuǎn)基因羊,其凈毛平均產(chǎn)量比非轉(zhuǎn)基因羊提高了6.2%。

2.轉(zhuǎn)基因動物的研究現(xiàn)狀(2)改變奶蛋白成分和性質(zhì)的設(shè)想在奶牛和奶羊上,轉(zhuǎn)基因的主要途徑是改變?nèi)榈某煞?、提高產(chǎn)乳量和生長速度。例如轉(zhuǎn)入一個超量表達(dá)的K酪蛋白基因能夠增加酪蛋白的產(chǎn)量。通過胚胎基因轉(zhuǎn)移技術(shù)導(dǎo)入原有基因的額外拷貝、采用某些奶蛋白高水平表達(dá)基因的調(diào)節(jié)序列以及轉(zhuǎn)移另一物種的奶蛋白基因或修飾基因,可以改變原有奶蛋白的成分和性質(zhì),如把人奶蛋白產(chǎn)物引入家畜奶中,以這種家畜的奶替代人奶,或增加牛奶中某些蛋白質(zhì)的濃度,改變牛奶加工處理的性能等,目前分離出改變奶成份的有關(guān)基因。(3)利用家畜生產(chǎn)藥物蛋白的研究htPA(人組織型纖溶酶原激活劑)五、轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用前景應(yīng)該看到,今天人類在轉(zhuǎn)基因動物方面所取得的成果還僅僅處在起步階段。隨著生命科學(xué)各個領(lǐng)域的不斷發(fā)展,新的突破會不斷產(chǎn)生,一些在實驗室中獲得的結(jié)果可以不斷地運用到生產(chǎn)實踐中去。例如,澳大利亞、新西蘭、南非、英國等主要產(chǎn)羊毛國家目前正在致力于開發(fā)一種可以生產(chǎn)彩色羊毛的高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因羊。類似的設(shè)想還很多,相信在未來,人們可以創(chuàng)造出更多有良好經(jīng)濟(jì)效益的物種,使地球的生物圈變得更加豐富多彩。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的誕生、成熟和推廣正在給養(yǎng)殖業(yè)帶來一場新的革命。轉(zhuǎn)基因存在的問題1.成本高,但是成功率低按供體進(jìn)行超排,獲取受精卵計算生產(chǎn)一頭轉(zhuǎn)基因豬$2.5萬,生產(chǎn)一頭轉(zhuǎn)基因牛$50萬。2.轉(zhuǎn)基因整合和表達(dá)效率低3.轉(zhuǎn)基因的遺傳率低轉(zhuǎn)基因動物及其后代并不能夠保證外源基因世代傳遞,外源基因很容易從基因組中丟失。ATA(G0)×ATA(G0)ATA(G0)×AA(非轉(zhuǎn)基因動物)↓↓ATAT:2ATA:AA=1:2:1ATA:AA=1:1理論上:轉(zhuǎn)基因動物為75%50%實際上:30%15.2%

通過檢驗,差異極顯著。4.存在與預(yù)期結(jié)果不相符的現(xiàn)象原因:(1)物種間的差異同一種疾病在不同的物種發(fā)病機(jī)制可能不同。(2)物種體內(nèi)有復(fù)雜的調(diào)控和平衡機(jī)制,單一外源基因?qū)游镎w的作用可能有限。(3)轉(zhuǎn)基因的整合、表達(dá)和調(diào)控不能達(dá)到真正人為控制。5.轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品制備導(dǎo)致了一些社會問題主要是產(chǎn)品的安全問題。第三節(jié)動物克隆技術(shù)一、動物克隆的概念

所謂克隆(cloning)就是無性繁殖,動物克隆(animalcloning)就是不經(jīng)過受精過程而獲得動物新個體的方法??寺游?cloninganimal)就是指不經(jīng)過生殖細(xì)胞而直接由體細(xì)胞獲得新的動物個體。

然而研究人員對克隆的具體定義仍存爭議,有些人認(rèn)為凡是不經(jīng)過受精過程而獲得新個體的方法叫克??;而另一些人則認(rèn)為只有像在植物中那樣,從一個具有全能性的體細(xì)胞直接再生出新個體才能叫克隆。但在目前的技術(shù)水平條件下,所有的高等動物體細(xì)胞都必須將其遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入卵細(xì)胞或原核胚后才能再生,也就是說,必須借助于卵細(xì)胞或原核胚的細(xì)胞質(zhì)中的某些特殊物質(zhì)才能進(jìn)行正常的生長發(fā)育,而不能從體細(xì)胞直接再生獲得新的個體。因此,按照后一種說法現(xiàn)在的所謂“克隆”動物其實都不是真正意義上的克隆。然而,目前人們所接受的克隆動物實際上是前一種比較寬松的克隆定義。

克隆動物技術(shù)實際上是結(jié)合采用了核移植與胚胎生物工程技術(shù)。其操作步驟大體為:1)體細(xì)胞的采集和培養(yǎng);使已失去全能性的體細(xì)胞恢復(fù)全能性;2)采集卵細(xì)胞并去除卵細(xì)胞的細(xì)胞核;3)取出體細(xì)胞的細(xì)胞核;4)用微注射法注入去除核的卵細(xì)胞中去;5)將重組胚細(xì)胞在體外進(jìn)行適當(dāng)培養(yǎng);6)將轉(zhuǎn)核胚置入同期母體子宮,完成發(fā)育,所產(chǎn)生的動物幼子為克隆動物。二、克隆動物的一般步驟克隆動物操作的一般步驟三、影響動物克隆的因素細(xì)胞融合的條件細(xì)胞發(fā)育階段可對核移植實驗產(chǎn)生影響

細(xì)胞誘導(dǎo)分裂成熟因子(MPF)的活性

卵細(xì)胞中的大分子物質(zhì)的影響四、克隆動物的意義與前景1.可以用于動物資源的種質(zhì)保存,可盡可能多地保存地球生物圈內(nèi)的多樣性。2.可以生產(chǎn)移植器官、利用動物作生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物和提供實驗動物,造福人類。還可以通過克隆哺乳動物某些特定發(fā)育階段的胎兒,對人類的某些頑癥實施“細(xì)胞治療”。3.可以克隆家畜和瀕臨滅絕的動物,如大熊貓等。4.利用哺乳動物體細(xì)胞克隆技術(shù),可通過建立轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞系的方式,克隆轉(zhuǎn)基因動物。體細(xì)胞克隆技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物,體細(xì)胞克隆中所生后代全都攜帶外源基因,可望降低生產(chǎn)成本。5.體細(xì)胞克隆技術(shù)可以直接把優(yōu)良物種特性傳遞下去,培育優(yōu)良物種,有助于縮短育種年限,加速動物育種進(jìn)程,提高育種效率。第四節(jié)胚胎生物工程技術(shù)

胚胎生物工程技術(shù)包括鮮胚和凍胚移植、胚胎分割、胚胎冷凍、冷胚切割、體外受精、胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)、分離與克隆等技術(shù),在國外已進(jìn)入實用性階段。MOET育種技術(shù)就是在此基礎(chǔ)上而產(chǎn)生的一種新的家畜育種技術(shù),即主要是利用超數(shù)排卵、人工授精、胚胎移植等生物工程技術(shù)來加快遺傳進(jìn)展和良種培育速度。胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)、分離與克隆技術(shù)的成功在胚胎工程中具有重要意義,它能夠有效解決胚胎細(xì)胞的來源。一、冷凍精液與人工授精技術(shù)

人工授精是利用器械采集公畜的精液,經(jīng)檢查和處理后,再用器械將精液輸入到發(fā)情母畜的生殖道內(nèi),以代替公、母畜自然交配而繁殖后代的一種技術(shù)。在動物育種中可以提高優(yōu)良種公畜的配種效能和種用價值,擴(kuò)大配種母畜的頭數(shù);加速家畜品種改良,促進(jìn)育種工作進(jìn)程。冷凍精液不但能夠提高優(yōu)秀種公畜的利用率,促進(jìn)品種改良,提高生產(chǎn)性能,而且使用冷凍精液不受地域、時間的限制,所以冷凍精液已成為目前動物遺傳資源保護(hù)、保存的重要方法之一。二、同期發(fā)情與超數(shù)排卵技術(shù)

同期發(fā)情技術(shù)主要是借助外源激素刺激卵巢,使其按照預(yù)定的要求發(fā)生變化,使所處理母畜卵巢生理機(jī)能都處于相同階段,從而使母畜在短時間內(nèi)統(tǒng)一發(fā)情,并能排出正常的卵母細(xì)胞,以便達(dá)到統(tǒng)一配種、受精、妊娠的目的。超數(shù)排卵是應(yīng)用外源性促性腺激素誘發(fā)卵巢多個卵泡發(fā)育,并一次排出具有受精能力的多個卵子的方法。對優(yōu)秀的母畜進(jìn)行超排處理,然后進(jìn)行授精,一次就可得到多個優(yōu)秀種畜的胚胎。

超數(shù)排卵是基礎(chǔ),胚胎移植是手段。三、胚胎冷凍保存與切割技術(shù)

胚胎冷凍保存一般是指在干冰(-79℃)和液氮(-196℃)中保存胚胎。其最大優(yōu)點是胚胎可以長期保存,而對其活力無影響。動物胚胎冷凍技術(shù)自建立以來,已進(jìn)行了改進(jìn),方法趨于簡單實用。這種方法也是動物遺傳資源保護(hù)的重要方法之一。四、胚胎移植技術(shù)

胚胎移植是將鮮胚或冷凍胚解凍后人為地注入受體動物的子宮角內(nèi),以完成胚胎發(fā)育。由于動物的大小不同,分手術(shù)法和非手術(shù)法兩種。五、胚胎干細(xì)胞技術(shù)

胚胎干細(xì)胞(ES)是胚胎發(fā)育早期還沒有分化的細(xì)胞,它具有向不同細(xì)胞分化的全能性。胚胎干細(xì)胞技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項具有發(fā)展?jié)摿Φ募夹g(shù)。胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)、分離與克隆,進(jìn)而建立不同動物的胚胎干細(xì)胞系已成為胚胎生物工程技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點。胚胎干細(xì)胞作為一種新型的實驗材料,廣泛應(yīng)用于動物克隆、轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)、真核細(xì)胞基因的表達(dá)與調(diào)控、人類遺傳病動物模型的創(chuàng)建,人類器官移植材料的生產(chǎn)以及細(xì)胞分化機(jī)制的研究等領(lǐng)域。胚胎干細(xì)胞分離與克隆技術(shù)、基因工程和胚胎工程相結(jié)合,對于闡明動物生長發(fā)育的基本規(guī)律、搶救和保護(hù)瀕危動物遺傳資源、建立先進(jìn)的動物育種技術(shù)體系具有重大的理論意義和實踐價值。六、MOET育種技術(shù)

MOET育種技術(shù)是動物胚胎生物工程技術(shù)在動物育種中的綜合運用。它是采用同期發(fā)情、超數(shù)排卵和胚胎移植等配套技術(shù)進(jìn)行優(yōu)質(zhì)動物個體快速擴(kuò)繁的一種方法。具體操作是對優(yōu)秀的母畜(供體)進(jìn)行超數(shù)排卵處理后,用特別優(yōu)秀的公畜交配,然后沖出胚胎,移植到同期發(fā)情的一般個體(受體)的子宮中完成胚胎發(fā)育過程,使一頭優(yōu)秀母畜一年可產(chǎn)眾多的優(yōu)秀后代。MOET育種技術(shù)目前已用于優(yōu)秀奶牛、肉牛、肉羊的快速擴(kuò)繁和育種。

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