HPLC法測(cè)定人血漿中萬(wàn)古霉素的血藥濃度

HPLC法測(cè)定人血漿中萬(wàn)古霉素的血藥濃度目的建立一種快速、靈敏且檢測(cè)范圍廣的HPLC法測(cè)定人血漿中萬(wàn)古霉素的濃度，為臨床萬(wàn)古霉素血藥濃度監(jiān)測(cè)、個(gè)體化給藥及指導(dǎo)用藥提供依劇。方法在不同流動(dòng)相配比、沉淀劑及柱溫條件下，高效液相色譜法測(cè)定人血漿中萬(wàn)古霉素，確定最佳的色譜條件和操作方法。采用外標(biāo)法定量，色譜柱：AgilentTC-C185u(150mm*4.6mm)；流動(dòng)相：9%乙腈-91%磷酸二氫鉀（PH3.2）；流速：1.0ml/min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：236nm；進(jìn)樣量：20ul。結(jié)果分析方法的線性范圍為4.69~300.16mg/L，回歸方程為Y=10526X-10533（r=0.9998，n=6），萬(wàn)古霉素的低、中、高（9.38、37.52、150.08mg/L）3種濃度的提取回收率介于90%~110%之間，日內(nèi)及日間精密度的RSD均小于6%。結(jié)論本方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確靈敏，適用于臨床萬(wàn)古霉素的血藥濃度監(jiān)測(cè)。關(guān)鍵詞：萬(wàn)古霉素，高效液相色譜法，血藥濃度 DeterminationofvancomycinconcentrationinhumanplasmabyHPLCObjective:Toestablishafast,andsensitivedetectionofawiderangeofHPLCmethodforthedeterminationofvancomycininhumanserumconcentration,clinicalvancomycinblooddrugconcentrationmonitoring,individualtoprovidethebasisfordrugsandmedicationguide.Methods:Chromatographicpeaksofserumvancomycinconcentrationunderdifferentmobilephase,precipitantandcolumntemperaturewereanalyzedtofindthebestchromatographicconditionandoperationmethod.Usingtheexternalstandardmethod,columnchromatography:AgilentTC-C185u(150mm*4.6mm),themobilephase:9%acetonitrile-91%potassiumdihydrogenphosphate(PH3.2),theflowrate:1.0ml/min,thecolumntemperature:25℃,thedetectionwavelength:236nm,andtheamountofsample:20ul.Results:Thelinearrangeofquantificationofserumvancomycinwas4.69~300.16mg/L.TheregressequationswasY=10526X-10533（r=0.9998，n=6）,Theextractionrecoveryofvancomycininlow,mediumandhighconcentrations(9.38、37.52、150.08mg/L)wereallbetween90%~110%.Theinter-dayandintra-dayrelativestandarddeviations(RSD)werelessthan6%.Conclusion:Themethodissimple,rapid,accurateandsensitive,andsuitableforclinicalmonitoringofbloodconcentrationofvoriconazole.Keywords:vancomycin;HPLC;blooddrugconcentration萬(wàn)古霉素（Vancomycin）是一種三環(huán)糖肽類(lèi)抗生素，對(duì)革蘭陽(yáng)性球菌有強(qiáng)大的抗菌作用，特別是對(duì)于目前臨床上較為棘手的嚴(yán)重耐藥金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌所致的感染有較好的療效[1]。萬(wàn)古霉素于1958年被批準(zhǔn)用于臨床使用，因其在嚴(yán)重感染中具有重要地位，因此，萬(wàn)古霉素曾被譽(yù)為“人類(lèi)對(duì)付頑固性耐藥菌株的最后一道防線”，通常在其他抗菌藥物無(wú)效時(shí)才應(yīng)用[2]。其主要的給藥方式是靜脈給藥，90%以上由腎臟排泄，萬(wàn)古霉素的抑菌機(jī)制之一是通過(guò)其七肽骨架與細(xì)菌細(xì)胞壁糖蛋白合成啟動(dòng)子——胞壁酰五肽的末端二肽片段D-Ala-D-Lac形成五個(gè)氫鍵來(lái)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞凋亡[3]。隨著萬(wàn)古霉素的大量使用，其不良反應(yīng)時(shí)有發(fā)生。萬(wàn)古霉素的耳、腎毒性限制了其臨床應(yīng)用，劑量過(guò)大服用藥過(guò)多和腎功能不全或老年患者更易發(fā)生耳腎毒性，因此應(yīng)用時(shí)必須嚴(yán)格控制給藥劑量并監(jiān)測(cè)血藥濃度[4]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)萬(wàn)古霉素的血藥濃度監(jiān)測(cè)多采用免疫檢測(cè)法、微生物法、高效液相色譜法等[5]。1實(shí)驗(yàn)材料1.1試劑乙腈（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140101）；磷酸二氫鉀（分析純，廣東光華科技股份有限公司，批號(hào)：20111129）；三氯醋酸（分析純，湖南匯虹試劑有限公司，批號(hào)：20140623）；磷酸（色譜純，上海士鋒生物科技有限公司，批號(hào)：T13200-500）；滅菌注射用水（安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)k17062107）；萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：130338-200303）1.2儀器與設(shè)備HITACHI高效液相色譜儀（日立高新技術(shù)公司）；AJXDC-10氮?dú)獯祾邇x（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；FA114A電子天平(萬(wàn)分之一)（上海海康電子儀器廠）；雷磁PHS-3C型PH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；TDL-80-2B低速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器）；HMS-350渦旋震蕩器（天津市威儀科技發(fā)展有限公司）；Lenovo微型計(jì)算機(jī)（新圓夢(mèng)F2028）（北京聯(lián)想有限公司）；微量進(jìn)樣器MC20μl（上海安亭微量進(jìn)樣器廠）2實(shí)驗(yàn)方法選擇2.1流動(dòng)相的考察本實(shí)驗(yàn)結(jié)合參考文獻(xiàn)，最終選擇流動(dòng)相為91%磷酸二氫鉀：9%乙腈(ph=3.22)。峰型良好，且無(wú)雜質(zhì)峰干擾。色譜圖如下：圖1-91%磷酸二氫鉀：9%乙腈(ph=3.22)2.1外標(biāo)法的選擇目前國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)多為內(nèi)標(biāo)法測(cè)定萬(wàn)古霉素血藥濃度，而去甲萬(wàn)古霉素、維生素B等內(nèi)標(biāo)物多為臨床常用藥，若患者同時(shí)使用萬(wàn)古霉素和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)可能作為內(nèi)源性雜質(zhì)干擾檢測(cè)結(jié)果，不能準(zhǔn)確計(jì)算萬(wàn)古霉素血藥濃度，因此本實(shí)驗(yàn)采取更為簡(jiǎn)便的外標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果。2.2血樣預(yù)處理的選擇萬(wàn)古霉素的提取方案有多種，國(guó)外多采用固相提取和在線提取，在線提取對(duì)儀器要求較高，本實(shí)驗(yàn)采用10%三氯醋酸對(duì)樣品進(jìn)行蛋白沉淀，得到很好的分離條件，因此確定為本實(shí)驗(yàn)血樣處理方案，圖2-三氯醋酸處理3方法與結(jié)果3.1血漿的來(lái)源采集健康體檢者的靜脈血，離心后，取上層清液用于制備空白血漿，備用。采集靜脈給予萬(wàn)古霉素進(jìn)行治療的患者的靜脈血，離心后，取上層清液備用，作為患者血漿樣品。3.2色譜條件色譜柱：AgilentTC-C185u(150mm*4.6mm)；流動(dòng)相：9%乙腈-91%磷酸二氫鉀（PH3.2）；流速：1.0ml/min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：236nm；進(jìn)樣量：20ul；采集時(shí)間：30min。3.3萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液精密稱(chēng)取萬(wàn)古霉素對(duì)照品56.3mg于50mL量瓶中，用注射滅菌用水溶解定容至刻度線，配制成濃度為1126mg/L的萬(wàn)古霉素對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于冰箱4℃冷藏保存?zhèn)溆谩?.4血漿樣品的處理將病人血樣以3500r/min離心5min后，吸取上層血清150uL于離心管中，10%三氯醋酸40uL，漩渦震蕩3min，13000r/min離心12min后，取上清液20uL進(jìn)樣，在上述色譜條件下測(cè)定，記錄萬(wàn)古霉素的峰面積。4方法學(xué)驗(yàn)證4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍取空白血漿100uL，置于試管中，精密量取不同質(zhì)量濃度、相同體積的萬(wàn)古霉素對(duì)照品稀釋儲(chǔ)備液50uL，混勻，制備成濃度分別為4.69、9.38、18.76、37.52、75.04、300.16mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下方法操作測(cè)定，經(jīng)HPLC分析，記錄色譜圖，測(cè)定結(jié)果如下表1。表1萬(wàn)古霉素進(jìn)樣濃度與峰面積關(guān)系(n=6)進(jìn)樣濃度（mg/L）4.699.3818.7637.5275.04300.16峰面積35909891861750223699738135903142869表1以萬(wàn)古霉素進(jìn)樣濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算回歸方程為Y=10526X+10533，r=0.9998。結(jié)果表明，綠原酸在4.69~300.16mg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系(圖3)。 圖34.2方法的專(zhuān)屬性分別取空白血漿和含藥血漿樣品，每個(gè)濃度各配制5份，按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下進(jìn)行處理，測(cè)得色譜圖。圖4-空白血漿圖5-含藥血漿4.3相對(duì)回收率試驗(yàn)取空白血漿，加入已知濃度的萬(wàn)古霉素對(duì)照品，配制成濃度分別為9.38、37.52、150.08mg/L的血漿樣品各5份，按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下進(jìn)行處理，測(cè)得回收率。精密度用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差RSD（RSD=SD/平均值*100%）表示，提取回收率用測(cè)得平均濃度/實(shí)際濃度*100表示。結(jié)果顯示（表2），提取回收率分別為107.02%，91.18%，106.56%。表2提取回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果加樣濃度（mg/mL）測(cè)得濃度（mg/mL）平均測(cè)得濃度（mg/mL）SDRSD(%)回收率(%)9.3810.1810.040.201.97107.029.8010.299.9210.0037.5233.6834.210.772.2591.1833.5635.1133.7234.99150.08162.22159.923.762.35106.56161.06156.79164.25155.284.4精密度試驗(yàn)血漿樣品的處理3萬(wàn)古霉素批內(nèi)、批間精密度（n=5）加樣濃度（mg/mL）測(cè)得濃度（mg/mL）平均濃度（mg/mL）SDRSD(%)第1日9.3810.189.8010.299.9210.0010.040.201.9737.5233.6833.5635.1133.7234.9934.210.772.25150.08155.28162.22161.06156.80164.25159.923.762.35第2日9.388.699.278.969.809.189.180.414.4937.5235.8436.1533.6837.0139.2736.392.025.56150.08147.56148.27155.28158.46142.79150.476.314.19第3日9.389.4410.029.359.768.999.510.394.1537.5235.2236.1839.4034.9839.3437.022.195.91150.08155.28153.27156.08147.28151.97152.783.472.274.5穩(wěn)定性試驗(yàn)將萬(wàn)古霉素的低、中、高濃度的血漿樣品避光放置在4℃的冰箱中冷凍0h,24h,48h，樣品經(jīng)不同條件保存后按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下操作進(jìn)行穩(wěn)定性考察，結(jié)果顯示（表4），精密度達(dá)到要求，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，萬(wàn)古霉素會(huì)降解。表4萬(wàn)古霉素穩(wěn)定性考察（n=5）加樣濃度（mg/mL）測(cè)得濃度（mg/mL）平均濃度（mg/mL）SDRSD0h24h48h9.388.178.188.258.200.040.5337.5239.6439.2339.3739.410.210.53150.08132.58134.51137.26134.782.351.745討論本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC法測(cè)定人血清中萬(wàn)古霉素的血藥濃度，在4.69~300.16mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；方法回收率均大于95%，精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)等的RSD也在規(guī)定范圍之內(nèi)，符合《中國(guó)藥典》中生物樣品測(cè)定的要求。本方法具有靈敏、準(zhǔn)確、測(cè)定成本低、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適用于人血清中萬(wàn)古霉素血藥濃度監(jiān)測(cè)，有利于患者個(gè)性化治療的安全實(shí)施，為臨床用藥劑量和給藥方案調(diào)整提供重要參考依據(jù)。參考