酵母雙雜交實驗步驟

LexA酵母雙雜交系統(tǒng)介紹一、LexA酵母雙雜交系統(tǒng)的設(shè)計原理報告質(zhì)粒p8op-LacZ的GAL4UAS編碼序列被完全去除，因此在缺少LexA融合激活劑的狀況下，報告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄活性為零，該基因的篩選標(biāo)志為URA3，能夠作為有自主復(fù)制能力的質(zhì)粒存在于酵母EGY48菌株中，也能夠被整合到EGY48基因組DNA上。質(zhì)粒pLexA的篩選標(biāo)志為HIS3，在雙雜交系統(tǒng)中用于體現(xiàn)DNA-BD(202個氨基酸殘基構(gòu)成的LexA蛋白)與目的蛋白(釣餌，Bait)的融合蛋白，該融合體的體現(xiàn)受酵母強啟動子ADH1的調(diào)控，選擇與報告基因的操縱子LexA×8結(jié)合。質(zhì)粒pB42AD的篩選標(biāo)志為TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位點(EcoRI與XhoI)上游，含有SV40核定位(SV40nuclearlocalization)、HA(血凝素)及AD(來自于的88個氨基酸殘基構(gòu)成的B42蛋白)等幾個編碼序列，共同構(gòu)成能夠啟動報告基因轉(zhuǎn)錄體現(xiàn)的激活成分。在酵母EGY48的基因組中還整合有另一種報告基因Leu，它與LacZ報告基因含有相似的操縱子-LexA，但兩者啟動子不同。根據(jù)雙雜交系統(tǒng)的原理，如果某一復(fù)合物同時含有DNA-BD和AD的活性，即可激活報告基因的轉(zhuǎn)錄和體現(xiàn)。分別將待測蛋白X、Y的編碼序列插入pLexA質(zhì)粒載體和pB42AD質(zhì)粒載體的多克隆位點中，然后共同轉(zhuǎn)入含有報告基因的酵母菌株，如果蛋白X與Y能互相作用，則啟動報告基因的轉(zhuǎn)錄和體現(xiàn)，通過檢測報告基因的體現(xiàn)狀況，就能夠間接反映蛋白X、Y與否含有互相作用以及作用的強弱。如果將蛋白Y換為取自組織或血液的cDNA文庫，則可用X從該文庫中篩選出能與其互相作用的蛋白，并且能夠獲得編碼這些蛋白的cDNA。二、商品化酵母雙雜交系統(tǒng)的構(gòu)成1.

載體質(zhì)粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文庫2.

酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侶菌株）3.

大腸桿菌菌株：KC8株4.

對照質(zhì)粒：質(zhì)粒

用途pLexA-53，pB42AD-T

陽性對照pLexA-Pos(LexA/GAL4AD融合蛋白〕

陽性對照pLexA-Lam(LaminC蛋白少與其它蛋白互相作用)

假陽性檢測質(zhì)粒5.

引物：pLexA測序引物及pB42AD測序引物。三、酵母雙雜交實驗的基本流程1.

將報告基因p8op-LacZ轉(zhuǎn)化酵母EGY48菌株，用培養(yǎng)基SD/-Ura篩選。2.

同時構(gòu)建或擴增DNA文庫，并純化足夠的質(zhì)粒以轉(zhuǎn)化酵母細胞。3.

構(gòu)建DNA-BD/靶蛋白質(zhì)粒pLexA-X，作為釣餌(bait)。4.

將上述釣餌質(zhì)粒pLexA-X轉(zhuǎn)化EGY48(p8op-LacZ)細胞株，用SD/-His/-Ura篩選；并用固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-His/-Ura檢測此DNA-BD/靶蛋白與否含有直接激活報告基因的活性，以及對酵母細胞與否含有殺傷毒性。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒

選擇培養(yǎng)基

克隆生長狀況

說明(含有Gal/Raf)

pLexA-Pos

SD/-His，-Ura

藍

陽性對照pLexA

SD/-His，-Ura

白

陰性對照PlexA-X

SD/-His，-Ura

白

沒有直接激活活性PlexA-X

SD/-His，-Ura

藍

含有直接激活活性PlexA-X

SD/-His，-Ura

菌落不能生長

酵母細胞毒性4-1.

如果pLexA-X-半乳糖苷酶的信號作用。能夠自動激活報告基因，則設(shè)法去除其激活活性部位、或者將LacZ報告基因整合入基因組，減少4-2.

如果pLexA-X即使不會自動激活報告基因，但對酵母宿主細胞有毒性，則需要與純化的文庫DNA同時轉(zhuǎn)化酵母。5.

如果pLexA-X既不會自動激活報告基因，也不含有毒性，則能夠與純化的文庫DNA同時、或次序轉(zhuǎn)化酵母細胞，并檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化

質(zhì)粒

SD固體培養(yǎng)基

LacZ表型對照1

pLexA-Pos

Gal/Raf/-His/-Ura

藍對照2

pLexA-53

Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu

藍＋pB42AD-T

實驗

pLexA-X

Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu

待測＋pB42AD-文庫

5-1.

用SD/-His/-Trp/-Ura培養(yǎng)基選擇陽性共轉(zhuǎn)化子，并擴增，使宿主細胞中的質(zhì)粒在誘導(dǎo)前達成最大拷貝數(shù)。-半乳糖苷酶無體現(xiàn)。5-2.

上述重組子轉(zhuǎn)至含X-gal的固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu，觀察LacZ及Leu報告基因的體現(xiàn)情形，藍色克隆即為陽性。白色克隆為假陽性，闡明Leu雖有體現(xiàn)，但5-3.

同時用LacZ、Leu兩個報告基因的目的，是為了盡量消除實驗的假陽性誤差，譬如：AD融合蛋白不與目的蛋白結(jié)合，而直接與啟動子序列結(jié)合域結(jié)合等狀況。由于2個報告基因的啟動子不同，出現(xiàn)上述假陽性的幾率就大大減少了。5-4.

將藍色陽性克隆進行1次以上的劃種，盡量分離克隆中的多個文庫質(zhì)粒。6.

陽性克隆的篩選6-1.

隨機選用50個陽性克隆，擴增、抽提酵母質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化KC8宿主菌，抽提大腸桿菌中的質(zhì)粒，酶切鑒定與否含有插入片段及排除相似的文庫質(zhì)粒。6-2.

如果重復(fù)的插入序列較多，可另取50個陽性克隆來分析。最后得到數(shù)種片段大小不同的插入序列，再轉(zhuǎn)化新的宿主細胞，檢測與否仍為陽性克隆。7.用質(zhì)粒自然分選法(NaturalSegregation)篩除只含有AD-文庫雜合子的克隆7-1.

將初步得到的陽性克隆接種SD/-Trp/-Ura液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)1-2天，含有HIS3編碼序列的BD-靶質(zhì)粒在含有外源His培養(yǎng)基中，將以10％-20％左右的頻率隨機丟失。C孵育2-3天。7-2.

將上述克隆，轉(zhuǎn)鋪固體培養(yǎng)基SD/-Trp/-Ura，307-3.

再挑取生長的單克隆，轉(zhuǎn)入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培養(yǎng)基中，篩選His表型缺點的克隆，即得到只含有AD-文庫雜合子的重組子。7-4.

將His表型缺點的克隆轉(zhuǎn)化固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura，以驗證AD-文庫能否直接激活報告基因的體現(xiàn)，棄去陽性克隆，保存陰性克隆。8.

酵母雜合實驗(YeastMating)擬定真陽性克隆以下表所示，在酵母EGY48及其對應(yīng)的YM4271宿主細胞中分別轉(zhuǎn)入對應(yīng)的質(zhì)粒或文庫DNA，通過雜合實驗確篩選pLexA-靶DNA與pB42AD-文庫確實含有互相作用的真陽性克隆。質(zhì)粒1(inYM4271)

質(zhì)粒2(inEGY48)

LacZ表型

Leu表型pLexA

pB42AD

白

不能生長pLexA-靶DNA

pB42AD

白

不能生長pLexA

pB42AD-文庫

白

不能生長pLexA-靶DNA

pB42AD-文庫

藍

真陽性pLexA-Lam

pB42AD-文庫

白

不能生長9.陽性克隆的進一步篩選和確證9-1.

擴增初步擬定的陽性克隆，抽提酵母DNA。該DNA為混合成分，既含有酵母基因組DNA，也含有3種轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA。9-2.

將上述DNA電轉(zhuǎn)化KC8宿主菌。由于在大腸桿菌中，含有不同復(fù)制起始調(diào)控序列的質(zhì)粒不相容；同時運用營養(yǎng)缺點型篩選。因此，在M9/SD/-Trp培養(yǎng)基上，只有含有AD-文庫質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌才干生長，將其擴增、并抽提質(zhì)粒DNA，酶切鑒定。9-3.

用pLexA-靶DNA與pB42AD-庫DNA一一對應(yīng)、共轉(zhuǎn)化只含有報告基因的酵母菌EGY48中，先到SD/-His/-Trp/-Ura板擴增，并與背面的誘導(dǎo)板形成對照，闡明報告基因的體現(xiàn)與誘導(dǎo)AD融合蛋白的體現(xiàn)有關(guān)，再確證LacZ、Leu報告基因的體現(xiàn)。9-4.

擴增與靶DNA互相作用的文庫DNA，進行序列分析及進一步的構(gòu)造、功效研究。10.對雙雜交系統(tǒng)陽性成果的進一步研究10-1.

用不同的雙雜交系統(tǒng)驗證10-1-1.

將載體pLexA與pB42AD交換后進行雙雜交實驗。10-1-2.

選擇不同的雙雜交系統(tǒng)，如：以GAL4轉(zhuǎn)錄激活子為基礎(chǔ)的雙雜交系統(tǒng)。10-1-3.

將文庫質(zhì)粒移碼突變后，再與靶質(zhì)粒作用，報告基因與否仍能被激活。-半乳糖苷酶水平，比較作用強度變化。10-1-4.

去除或突變特定結(jié)合位點，定量檢測10-2.

用試劑盒提供的引物測定插入片段的DNA序列，證明其編碼區(qū)域。10-3.

用其它的檢測辦法，如：親和色譜法或免疫共沉淀法來證明雙雜交系統(tǒng)篩選的蛋白之間的含有互相作用。10-4.

進一步研究靶蛋白與篩選蛋白之間的功效關(guān)系構(gòu)建于AD載體的cDNA文庫的擴增1.

自-80℃冰箱取出含有cDNA文庫的甘油菌，置于冰浴中緩慢化凍。2.

用新鮮的LB培養(yǎng)液在離心管中將上述甘油菌1:106和1:108稀釋。ll加入903.

取稀釋菌液各1090mm)；37℃倒置培養(yǎng)過夜或30℃培養(yǎng)24-36hr，計數(shù)平板上單克隆菌落數(shù)。LB培養(yǎng)液在離心管中振蕩混勻，涂布LB/Amp平板(4.

擬定待擴增的cDNA文庫滴度(cfu/ml)=克隆數(shù)×108(1:106稀釋)或克隆數(shù)×1010(1:108稀釋)。5.

按照>150mm)，共100塊；37℃倒置培養(yǎng)過夜。2-4×104cfu/平板的濃度，涂布LB/Amp平板(6.

在超凈工作臺上，在全部生長菌落的平板上加適量LB培養(yǎng)液，將菌落刮下，轉(zhuǎn)入mlLB/Amp培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)2-4hr。7.

留取適量培養(yǎng)菌液以50%無菌甘油稀釋至25%終濃度，分裝，保存于-80℃。8.

其他培養(yǎng)菌液離心8000xg×10min，4℃收集細菌；用質(zhì)粒DNA純化試劑盒大量抽提質(zhì)粒DNA。LB液體培養(yǎng)基，121℃，15lb/in2滅菌15minA.

bacto-Tryptone

B.

bacto-YeastExtract

C.

NaCl

D.

ddH2O→

1000ml*LB固體培養(yǎng)平板為含有%瓊脂(Agar)LB培養(yǎng)基。**LB/Amp培養(yǎng)基為含有Ampg/ml的LB培養(yǎng)基。50-100構(gòu)建于AD載體的cDNA文庫的純化1.

質(zhì)粒DNA提取緩沖液名稱

緩沖液

配方g/mlRNaseP1

懸浮緩沖液

50mMTris-HCl；10mMEDTA；100AP2

裂解緩沖液

200mMNaOH；1%SDSP3

中和緩沖液

KacQBT

平衡緩沖液

750mMNaCl；50mMMOPS；15%異丙醇；%TritonX-100QC

洗滌緩沖液

MNaCl；50mMMOPS；15%異丙醇QF

洗脫緩沖液

MNaCl；50mMTris-HCl；15%異丙醇2.

培養(yǎng)菌液離心6000xg×10min，4℃，每500ml培養(yǎng)物(下同)的沉淀重懸于50mlP1緩沖液。3.

加入50mlP2緩沖液，倒置4-6次混勻，室溫孵育5min。4.

加入4℃預(yù)冷的50mlP3緩沖液，快速倒置4-6次混勻，冰浴30min(其間再倒置混勻4-6次)。5.

將上述混合液再倒置混勻，離心1xg×30min，4℃，保存上清。6.

上清再離心1xg×15min，4℃，留上清。7.

將上清液上樣于經(jīng)35mlQBT緩沖液平衡的QIAGEN-tip層析柱。8.

以100mlQC緩沖液洗滌層析柱2次。9.

以35mlQF緩沖液洗脫吸附于層析柱上的DNA。10.

以倍體積異丙醇沉淀DNA，離心12500xg×30min，4℃，小心去除上清。11.

以7ml70%乙醇洗滌沉淀DNA，離心12500xg×10min，4℃，小心去除上清。12.

將沉淀的質(zhì)粒DNA溶于5mlTE緩沖液，轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中，用倍體積無水乙醇；1/10體積NaAc，于-20℃靜置過夜。13.

離心12500xg×20min，4℃，去除上清，沉淀用70%乙醇洗滌，超凈臺風(fēng)干。l)，保存于-20℃。g/管(用于1次轉(zhuǎn)化反映，約4014.

干燥的DNA溶于適量體積TE，定量，分裝100-200構(gòu)建于DNA-BD載體的目的DNA轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞1.

將酵母菌EGY48(p8op-lacZ)接種于SD/-Ura液體培養(yǎng)基中，緩振打散菌落，然后轉(zhuǎn)入SD/-Ura液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr，至OD600>。SD/-Ura液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.

DifcoNitrogen

B.

葡萄糖

C.

10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)

D.

20×His

E.

20×Leu

F.

20×Trp

G.

ddH2O→

2.

將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300mlYPD，至OD600=約50ml)，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=約3hr)。YPD液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.

Polypepton

B.

bacto-YeastExtract

C.

葡萄糖

D.

ddH2O→

300ml3.

室溫離心5000xg×5min，棄上清；加入15-25mlddH2O重懸洗滌沉淀酵母細胞，離心棄上清，沉淀用1×TE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細胞。4.

準備下列試劑2×轉(zhuǎn)化反映

10×TE

10×LiAc

50%PEG

ddH2Oll

/

120l

15A.

1×TE/LiAc

15l

/l

960l

120B.

PEG/LiAc

120ll

/

/

900C.

1×TE

1005.

分裝待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA，振蕩混勻。lg)

3-5A.

pLexA-XB.

10mg/mllSpermDNA*

10*新配制時水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。l用1×TE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細胞，振蕩混勻。6.

每管加入100l7.

各加入600PEG/LiAc，振蕩混勻，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)30min。l8.

各加入70DMSO緩和倒置混勻。42℃熱休克15min，快速插入冰浴。9.

室溫離心13000xg×10sec，盡量棄上清；以1×TE重懸沉淀細胞，涂布SD/-Ura，-His固體培養(yǎng)板，30℃倒置培養(yǎng)3-5天。SD/-Ura，-His固體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15min稍冷卻后鋪板A.

DifcoNitrogen

B.

葡萄糖

C.

10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)

D.

20×Leu

E.

20×Trp

F.

Agar

G.

ddH2O90-100mm)→

鋪8-10塊平板(附表1.不同規(guī)模轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞SmallScale*

LargeScale

LibraryScale轉(zhuǎn)化反應(yīng)

20

1

1(1)

SD液體培養(yǎng)基擴增酵母菌

100ml

100ml

300ml(2)

YPD液體培養(yǎng)基擴增酵母菌

300mla

300mla

1000mla(3)

TE或ddH2O洗滌酵母細胞

15mlc

25-50mlb

500mla(4)

準備A.1×TE/LiAc緩沖液

B.PEG/LiAc緩沖液

C.1×TE緩沖液

(5)

分裝A.DNA-BDvectorgd×20

/

gd

10-50B.ADvector

C.l

l×20

200SpermDNA(10mg/ml)

10

1×TE/LiAc重懸感受態(tài)細胞

l×20

酵母感受態(tài)細胞

100(7)

PEG/LiAc緩沖液

×20

l

l×20

700

DMSO

70(9)

室溫離心后棄上清

13000xg×10sec

xg×5min

xg×5min(10)

1×TE重懸感受態(tài)細胞

×20

150mm×50150mm×30

90mm×20

鋪固體選擇培養(yǎng)基平板

注:*即為“構(gòu)建于DNA-BD載體的目的DNA轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞”**在不同容積的無菌離心管中進行，a:300或500ml；b:50ml；c:15ml；d:文庫cDNA轉(zhuǎn)化含有DNA-BD載體的酵母感受態(tài)細胞1.

以生長于SD/-Ura，-His固體培養(yǎng)板上的含有構(gòu)建于DNA-BD載體的目的DNA及報告基因(p8op-lacZ)的酵母菌EGY48作為宿主菌，制備酵母感受態(tài)細胞。2.

將酵母宿主菌接種于SD/-Ura，-His液體培養(yǎng)基中，緩振打散菌落，然后轉(zhuǎn)入SD/-Ura，-His液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr，至OD600>。SD/-Ura，-His液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.

DifcoNitrogen

B.

葡萄糖

C.

10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)

D.

20×Leu

E.

20×Trp

F.

ddH2O→

3.

將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300mlYPD，至OD600=約50ml)，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=約3hr)。YPD液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.

Polypepton

B.

bacto-YeastExtract

C.

葡萄糖

D.

ddH2O→

300ml4.

室溫離心5000xg×5min，棄上清；加入15-25mlddH2O重懸洗滌沉淀酵母細胞，離心棄上清，沉淀用1×TE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細胞。5.

準備下列試劑1×轉(zhuǎn)化反映

10×TE

10×LiAc

50%PEG

ddH2Oll

/

800l

100A.

1×TE/LiAc

100l

/l

600B.

PEG/LiAc

600C.

1×TE

/

/

6.

取用1×TE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細胞，加入下列成分，振蕩混勻。lg)

40A.

pB42AD-Library(50-100B.

10mg/mllHerringDNA*

200*新配制時水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。7.

加入PEG/LiAc，振蕩混勻，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)30min。l8.

加入700DMSO緩和倒置混勻。42℃熱休克15min，快速插入冰浴。9.

室溫離心xg×5min，盡量棄上清。10.

以100mm，每稀釋度各×2)，30℃倒置培養(yǎng)3-5天，擬定轉(zhuǎn)化效率在2×106cfu以上有效。l稀釋不同倍數(shù)，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板(1×TE重懸沉淀細胞，取10150mm×30)，30℃倒置培養(yǎng)3-5天。l涂布SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板(11.

按每板200SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15min稍冷卻后鋪板A.

DifcoNitrogen

B.

葡萄糖

C.

10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)

D.

20×Leu

E.

Agar

F.

ddH2O150mm)→

鋪30塊平板(12.

在超凈工作臺上，在全部生長菌落的平板上各加5mlTE緩沖液，將菌落刮下。13.

離心棄上清，加入10-20mlTE緩沖液重懸沉淀菌，加入等體積的無菌65%甘油-MgSO4緩沖液，混勻，分裝管，保存于4℃1周或-80℃1年以上。65%甘油-MgSO4緩沖液:65%甘油；100mMMgSO4；25mMTris-HClA.

甘油

B.

MgSO4?7H2O

C.

MTris-HCl

D.

ddH2O→

酵母雙雜合系統(tǒng)陽性克隆的篩選1.

通過選擇培養(yǎng)基篩選的含有DNA-BD載體、文庫DNA及報告基因的酵母感受態(tài)細胞，用無菌TE稀釋至1:104、1:106和1:108等不同濃度。90mm)，30℃倒置培養(yǎng)3-5天，計數(shù)平板上單克隆菌落數(shù)。l，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板(2.

取上述稀釋菌液各1003.

擬定待進一步鑒定的酵母菌滴度(cfu/ml)=克隆數(shù)×105(1:104稀釋)、克隆數(shù)×107(1:106稀釋)或克隆數(shù)×109(1:108稀釋)。4.

按照以前實驗擬定的文庫轉(zhuǎn)化效率的5-10倍的總量、×106cfu/平板的菌量，涂布SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)板，30℃倒置培養(yǎng)3-5天。5.

挑取顯藍色的菌落，再接種于SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)基以及SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以進一步確證。SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基A.

SD/Gal/Raf

B.

10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)

C.

Agar

D.

ddH2O→

滅菌(115℃，10lb/in2)15min，冷卻至50℃，加入下列成分后鋪板E.

10×BU

F.

20mg/mlX-gal

90-100mm)鋪5-6塊平板(10×BU緩沖液，121℃，15lb/in2滅菌15minA.

Na2HPO4?12H2O

B.

NaH2PO4?2H2O

C.

ddH2O→

20mg/mlX-GalA.

X-Gal

40mgB.

DMF

2ml酵母雙雜合系統(tǒng)陽性克隆的鑒定-酵母質(zhì)粒DNA的提取1.

挑取通過酵母選擇/誘導(dǎo)培養(yǎng)基初步鑒定的酵母單菌落，接種于SD/-Trp液體培養(yǎng)基，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)20hr。SD/-Trp液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.

DifcoNitrogen

B.

葡萄糖

C.

10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)

D.

20×His

E.

20×Leu

F.

20×Ura

G.

ddH2O→

2.

室溫離心5000xg×1min，棄上清，收菌。l酵母裂解液，振蕩重懸沉淀酵母菌。3.

加入200酵母裂解液:2%TritonX-100；1%SDS；100mMNaCl；10mMTris-HCl；1mMEDTAA.

10%TritonX-100

B.

10%SDS

C.

NaCl

D.

Tris

E.

EDTANa2?2H2O

F.

HCl調(diào)

G.

ddH2O→

4.

加入下列試劑，充足振蕩5min；液氮凍存10min，室溫復(fù)融；再充足振蕩5min。A.

經(jīng)酸解決的玻璃珠(Sigma)

B.

苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)

5.

室溫離心1xg×10min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入下列試劑，于-70℃凍存30-60min。A.

3MNaAc(1/10lV)

20lB.

無水乙醇

5006.

離心12500xg×10min，4℃，棄上清；70%乙醇洗滌沉淀，于37℃烘箱或超凈臺干燥DNA；將干燥的沉淀DNA重溶于l無菌ddH2O中，保存于-20℃。20-30酵母雙雜合系統(tǒng)陽性克隆的鑒定-酵母質(zhì)粒DNA電轉(zhuǎn)化大腸桿菌1.

在冰浴條件下，取待轉(zhuǎn)化DNAl感受態(tài)細胞中，混勻。g)，加入100lF，2002.

將上述混合液加入間距的樣品杯中，電轉(zhuǎn)化，25。3.

快速加入1ml新鮮的LB培養(yǎng)液，混勻，轉(zhuǎn)入離心管中，37℃恒溫，150rpm振蕩孵育30-60min。4.

將上述轉(zhuǎn)化反映液涂布M9/DO(-Trp)固體培養(yǎng)板，37℃倒置培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)(16-22hr)。5.

按常規(guī)辦法擴增上述陽性轉(zhuǎn)化菌，堿裂解法少量抽提質(zhì)粒DNA，酶切篩選AD載體上含有插入片段的陽性克隆，保存其于25%甘油，待進一步驗證。M9/DO-Trp固體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.

葡萄糖

B.

Agar

C.

5×M9緩沖液

60mlD.

10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)

30mlE.

20×His

15mlF.

20×Leu

15mlG.

20×Ura

15mlH.

ddH2O

165ml冷卻至50℃左右，加入下列成分，混勻鋪板I.

Thiamine-HCl

mlJ.

100mg/mlAmp

ml

90-100mm)鋪10-15塊平板(大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備(電轉(zhuǎn)化)1.

挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的KC8單菌落，接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)過夜(約12-14hr)。2.

將ml新鮮菌液接種于500mlSOB培養(yǎng)液中，37℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=約。SOB液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.

bacto-Tryptone

B.

bacto-YeastExtract

C.

NaCl

D.

KCl

E.

MgCl2?6H2O

F.

ddH2O→

3.

將培養(yǎng)菌液收集于離心管中，冰水浴15-20min。4.

離心6000xg×10min，4℃，棄盡上清；以5ml預(yù)冷的無菌ddH2O重懸沉淀菌；再加入500ml預(yù)冷的無菌ddH2O洗滌細菌。5.

重復(fù)上述環(huán)節(jié)1次，以充足去除培養(yǎng)基中殘存的鹽離子成分。6.

用40-50ml預(yù)冷的無菌10%甘油重懸沉淀細菌，轉(zhuǎn)移至50ml無菌離心管中；離心6000xg×10min，4℃，棄盡上清；重復(fù)此環(huán)節(jié)1次。7.

以等體積(約預(yù)冷的無菌10%甘油重懸上述沉淀的感受態(tài)細胞，分裝管(5-6次轉(zhuǎn)化反映)，保存于-80℃?zhèn)溆?。酵母雙雜合系統(tǒng)陽性克隆確實證1.

以含有報告基因(p8op-lacZ)的酵母菌EGY48作為轉(zhuǎn)化宿主菌。2.

將酵母宿主菌接種于SD/-Ura液體培養(yǎng)基中，緩振打散菌落，然后轉(zhuǎn)入SD/-Ura液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr，至OD600>。SD/-Ura液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.

DifcoNitrogen

B.

葡萄糖

C.

10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura)

D.

20×His

E.

20×Leu

F.

20×Trp

G.

ddH2O→

3.

將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300mlYPD，至OD600=約50ml)，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=約3hr)。YPD液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15minA.

Polypepton

B.

bacto-YeastExtract

C.

葡萄糖

D.

ddH2O→

300ml4.

室溫離心5000xg×5min，棄上清；加入15-25mlddH2O重懸洗滌沉淀酵母細胞，離心棄上清，沉淀用1×TE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細胞。5.

準備下列試劑20×轉(zhuǎn)化反映

10×TE

10×LiAc

50%PEG

ddH2Ol

/

l

150A.

1×TE/LiAc

150B.

PEG/LiAc

/C.

1×TE

/

/

6.

分裝待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA。A.

pLexAlg)

3-5orpLexA-Xlg)

3-5B.

pB42AD-YC.

10mg/mlSpermlDNA*

10*新配制時水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。l用1×TE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細胞，振蕩混勻。7.

每管加入100l8.

各加入600PEG/LiAc，振蕩混勻，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)30min。l9.

各加入70DMSO緩和倒置混勻。42℃熱休克15min，快速插入冰浴。10.

室溫離心13000xg×10sec，盡量棄上清；以1×TE重懸沉淀細胞，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板，30℃倒置培養(yǎng)3-5天。SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15min稍冷卻后鋪板A.

Difco