抗（抑）菌試驗(yàn)資料

抗（抑）菌試驗(yàn)1目的最小抑制濃度測(cè)定試驗(yàn)、洗衣粉抗菌效果測(cè)定試驗(yàn)、振蕩燒瓶試驗(yàn)、浸漬試驗(yàn)與奎因試驗(yàn)，可視情況選用。2抑菌環(huán)試驗(yàn)2.1原理利用抑菌劑不斷溶解經(jīng)瓊脂擴(kuò)散形成不同濃度梯度，以顯示其抑菌作用。試驗(yàn)通過抑菌環(huán)大小以判斷其是否具有抑菌能力。本試驗(yàn)適用于抑菌劑與溶出性抗（抑）菌產(chǎn)品的鑒定。2.2試驗(yàn)器材(1)金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、大腸桿菌(8099)、白色念珠菌(ATCC10231)菌懸液(見2.1.1.2)及根據(jù)抑菌劑特定用途所用的其他菌懸液。(2)抑菌劑載體(5mm直徑園形新華一號(hào)定性濾紙片，經(jīng)壓力蒸汽滅菌處理后，置120℃烤干2h，保存?zhèn)溆?。(3)活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)所需器材(見2.1.1.3)。(4)微量移液器(5μl～50μl，可調(diào)式)。(5)游標(biāo)卡尺。(6)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基與沙堡瓊脂培養(yǎng)基2.3操作程序(1)抑菌片的制備:對(duì)液體抑菌劑，取無菌并干燥的濾紙片。每片滴加實(shí)際使用濃度抑菌劑溶液20μl，然后將濾紙片平放于清潔的無菌平皿內(nèi)，開蓋置溫箱(37℃)中烤干，或置室溫下自然干燥后備用。溶出性抗（抑）菌產(chǎn)品，可直接制成直徑為5mm，厚不超過4mm圓片(塊)，每4片(塊)一組。(2)陰性對(duì)照樣片的制備:取無菌干燥濾紙片，每片滴加無菌蒸餾水20μl，干燥后備用。溶出性抗（抑）菌產(chǎn)品的陰性對(duì)照樣本，應(yīng)取同種材質(zhì)不含抑菌成份的樣品，制成與試驗(yàn)組大小相同的樣片(塊)。(3)試驗(yàn)菌的接種:用無菌棉拭子蘸取濃度為5×105cfu/ml～5×106cfu/ml試驗(yàn)菌懸液，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板表面均勻涂抹3次。每涂抹1次，平板應(yīng)轉(zhuǎn)動(dòng)60°，最后將棉拭子繞平板邊緣涂抹一周。蓋好平皿，置室溫干燥5min。(4)抑菌劑樣片貼放:每次試驗(yàn)貼放1個(gè)染菌平板，每個(gè)平板貼放4片試驗(yàn)樣片，1片陰性對(duì)照樣片，共5片。用無菌鑷子取樣片貼放于平板表面。各樣片中心之間相距25mm以上，與平板的周緣相距15mm以上。貼放好后，用無菌鑷子輕壓樣片，使其緊貼于平板表面。蓋好平皿，置37℃溫箱，培養(yǎng)16h～18h觀察結(jié)果。用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)的直徑(包括貼片)并記錄。試驗(yàn)重復(fù)3次。測(cè)量抑菌環(huán)時(shí)，應(yīng)選均勻而完全無菌生長(zhǎng)的抑菌環(huán)進(jìn)行。測(cè)量其直徑應(yīng)以抑菌環(huán)外沿為界。2.4評(píng)價(jià)規(guī)定(1)抑菌作用的判斷:抑菌環(huán)直徑大于7mm者，判為有抑菌作用。抑菌環(huán)直徑小于或等于7mm者，判為無抑菌作用。(2)3次重復(fù)試驗(yàn)均有抑菌作用結(jié)果者，判為合格。(3)陰性對(duì)照組應(yīng)無抑菌環(huán)產(chǎn)生。否則試驗(yàn)無效。2.5注意事項(xiàng)(1)每次試驗(yàn)均應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照，不可省略。在報(bào)告中亦必須將對(duì)照組的結(jié)果列出。(2)接種用細(xì)菌懸液的濃度應(yīng)符合要求。濃度過低，接種菌量少，抑菌環(huán)常因之增大;濃度過高，接種量過多，抑菌環(huán)則可減小。(3)應(yīng)保持瓊脂濃度的準(zhǔn)確性，否則可影響抑菌環(huán)的大小。(4)培養(yǎng)時(shí)間不得超過18h。培養(yǎng)過久，部分細(xì)菌可恢復(fù)生長(zhǎng)，抑菌環(huán)變小。(5)抑菌環(huán)直徑可受抑菌劑的量、抑菌性能和干濕度影響。故抑菌劑濾紙片應(yīng)在試驗(yàn)當(dāng)天制備。3最小抑菌濃度測(cè)定試驗(yàn)（瓊脂稀釋法）3.1原理本試驗(yàn)采用瓊脂稀釋法將不同濃度的抑菌劑混合溶解在瓊脂培養(yǎng)基中，然后點(diǎn)種細(xì)菌，通過細(xì)菌的生長(zhǎng)與否，確定抗（抑）菌物質(zhì)抑制受試菌生長(zhǎng)的最低濃度，即最小抑菌濃度(MinimalInhibitoryConcentration，MIC)。本方法適用于不溶性抗（抑）菌產(chǎn)品。3.2試驗(yàn)器材（1）菌株金黃色葡萄球菌ATCC6538，大腸桿菌8099或ATCC11229。可根據(jù)抑菌劑的用途，選擇特定的菌株。（2）水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（MH），稱取38gMH瓊脂培養(yǎng)基，溶于1000ml水中，加熱至沸騰溶解，然后121℃高壓滅菌15min，置45℃～50℃水浴備用，此培養(yǎng)基將用于對(duì)照試驗(yàn)。（3）0.03mol/L磷酸鹽緩沖液pH7.2。（4）加樣器（1μl～10μl）。（5）45℃～50℃水浴恒溫箱。（6）吸管、試管、平皿。（7）37℃培養(yǎng)箱。3.3操作步驟（1）抗（抑）菌溶液的配制：以無菌操作取5ml或5g（固體研磨后）樣品，放入45ml滅菌磷酸緩沖液中，充分震蕩溶解，配成10%的均勻分散的溶液或懸液。（2）含抗菌劑培養(yǎng)基配制：將已配成10%的抗（抑）菌溶液或懸液用PBS做對(duì)倍系列稀釋成不同濃度的受試液，置45℃～50℃水浴恒溫備用。（3）雙倍濃度培養(yǎng)基配制：稱取76gMH瓊脂培養(yǎng)基，溶于1000ml水中。加熱至沸騰溶解。然后121℃壓力蒸汽滅菌15min，置45℃～50℃水浴備用。此培養(yǎng)基將用于稀釋抗（抑）菌溶液或懸液。（4）含抗（抑）菌液培養(yǎng)基的配制：分別取10ml系列稀釋的抗菌液加入平皿內(nèi)。將在45℃～50℃水浴中的雙倍MH瓊脂培養(yǎng)基10ml，加入平皿內(nèi)，邊加邊搖晃平板，使抗（抑）菌液和培養(yǎng)基充分混勻，待凝固后備用。（5）用加樣器取1μl～2μl（含菌量約為107cfu/ml）菌懸液點(diǎn)種于含抗（抑）菌液培養(yǎng)基的平皿，接種后所形成的菌液圈直徑約5mm～8mm（每個(gè)點(diǎn)菌量約為104cfu）。（6）以同樣方法接種不含抗（抑）菌成分的MH瓊脂平板，作為陽性對(duì)照。（7）將接種后的平板放置35℃培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)18h～24h，觀察結(jié)果。3.4評(píng)判規(guī)定菌落生長(zhǎng)被完全抑制的最低抗（抑）菌液濃度為該樣品對(duì)受試菌的MIC。單一菌落生長(zhǎng)可忽略不計(jì)。3.5注意事項(xiàng)（1）接種時(shí)，應(yīng)由低抗（抑）菌劑濃度向高濃度平板依次接種，最后接種對(duì)照平板。（2）為了保證平板受熱均勻，培養(yǎng)時(shí)平板堆放不得超過4個(gè)。4最小抑菌濃度測(cè)定試驗(yàn)（營(yíng)養(yǎng)肉湯稀釋法）4.1原理本試驗(yàn)將不同濃度的抑菌劑混合溶解于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，然后接種細(xì)菌，通過細(xì)菌的生長(zhǎng)與否，確定抗（抑）菌劑抑制受試菌生長(zhǎng)的最低濃度，即最小抑菌濃度(MinimalInhibitoryConcentration，MIC)。本方法式用于可溶性抑菌產(chǎn)品。4.2試驗(yàn)器材（1）試驗(yàn)菌株：金黃色葡萄球菌ATCC6538，大腸桿菌8099或ATCC11229?？筛鶕?jù)抑菌劑的用途，選擇特定的菌株。（2）營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，見附錄A。（3）稀釋液，見附錄A。（4）吸管、試管（5）37℃培養(yǎng)箱。4.3操作步驟（1）按2.1.1.2所示方法制備的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌懸液（2）含抗菌劑培養(yǎng)基配制：將抗（抑）菌溶液用蒸餾水做對(duì)倍系列稀釋成不同濃度的受試液，取各稀釋度受試液2.5ml加入到含2.5ml雙倍濃度營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中。（3）取0.1ml含菌量約為108cfu/ml菌懸液接種于含抗（抑）菌劑的營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中，作為試驗(yàn)組樣本。（4）以同樣方法接種不含抗（抑）菌劑的營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中，作為陽性對(duì)照組樣本。（5）取2支含營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中，作為陰性對(duì)照組樣本。（6）將試驗(yàn)組樣本、陽性對(duì)照組樣本及陰性對(duì)照組樣本放置37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。（7）試驗(yàn)中應(yīng)將試驗(yàn)用菌懸液進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)，其作用濃度應(yīng)為5×105cfu/ml～5×106cfu/ml。4.4評(píng)判規(guī)定當(dāng)陽性對(duì)照管有細(xì)菌生長(zhǎng)(混濁)，陰性對(duì)照管無菌生長(zhǎng)(透明)，試驗(yàn)用菌懸液的作用濃度為5×105cfu/ml～5×106cfu/ml時(shí)，試驗(yàn)組無菌生長(zhǎng)的最高稀釋度所對(duì)應(yīng)的抗（抑）菌劑濃度，為該樣品對(duì)受試菌的MIC。4.5注意事項(xiàng)接種時(shí)，應(yīng)由低抗（抑）菌劑濃度向高濃度依次接種，55.1原理本試驗(yàn)通過模擬適合細(xì)菌生長(zhǎng)、繁殖和可能產(chǎn)生感染的皮膚條件下，使用隨機(jī)性、雙盲的、配對(duì)比較的方法檢測(cè)抗（抑）菌香皂和抗菌沐浴露12h或24h的滯留抑菌效果。5.2試驗(yàn)器材(1)試驗(yàn)產(chǎn)品:試驗(yàn)品為25套按順序編號(hào)的香皂樣品。每套2塊，一塊為測(cè)試樣品皂，另一塊為不含抑菌劑的對(duì)照皂。(2)不含抑菌劑的洗發(fā)水25瓶（200ml/瓶）(3)不含抑菌劑的香皂25塊(4)胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)(5)胰蛋白酶大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）(6)0.075mol/L的磷酸鹽緩沖液(7)70%酒精(8)恒溫箱(9)金屬筒（直徑2.2cm、高度3cm）(10)一次性接種環(huán)（直徑4mm）(11)小塑料碗（直徑2.2cm，高2.5mm，）(12)膠帶（Darapore，3M公司生產(chǎn)）(13)尼龍刮菌棒(14)Triton-X100500ml(15)外用抗生素軟膏(例如:百多邦莫匹羅星軟膏)(16)玻璃彎棒(17)羊血(18)金黃色葡萄球菌ATCC27217（此株金黃色葡萄球菌是一種低毒性、對(duì)青霉素敏感、對(duì)四環(huán)素有抗藥性的色素株，曾用于許多試驗(yàn)研究，沒有任何嚴(yán)重副作用）。(19)皮膚消毒劑5.3試驗(yàn)步驟(1)調(diào)整階段試驗(yàn)開始前7d至14d，受試者使用不含抗（抑）菌成分的香皂、洗發(fā)水和沐浴液進(jìn)行日常的洗手、洗澡。此階段持續(xù)至少7d，但不超過14d。(2)清洗階段清洗階段共3d，受試者每天用抑菌皂清洗一側(cè)前臂，用對(duì)照皂清洗另一側(cè)前臂，清洗過程如下:1）先清洗左臂，用流動(dòng)水（水溫應(yīng)保持在35℃～37℃）打濕前臂內(nèi)側(cè)；2）用香皂從手腕至臂肘上下摩擦15s；3）用手在涂有香皂的手臂上上下摩擦泡沫45s；4）用流動(dòng)的清水沖洗前臂15s，不要搓擦；5）用紙巾沾干前臂.不要搓擦；6）重復(fù)以上步驟清洗右臂；7）按上面所描述的試驗(yàn)步驟每日清洗前臂3次，每次間隔至少一個(gè)小時(shí)，在最后一次清洗之后，需記錄好時(shí)間，在12h之后，進(jìn)行滯留效果檢測(cè)。在第9次清洗前臂以后，受試者不能洗澡、淋浴或洗凈前臂，直到試驗(yàn)結(jié)束。用品包的標(biāo)簽上注明洗哪只手臂。清洗前后的兩塊香皂的重量及受試者完成清洗的情況，須記錄下來。（3）試驗(yàn)階段清洗階段的第四天(最后一次清洗后12h或24h)，將在受試者每只前臂上劃出一個(gè)試驗(yàn)區(qū)，對(duì)試驗(yàn)區(qū)進(jìn)行接種、封包和回收存活細(xì)菌，具體步驟如下:1）將金黃色葡萄球菌（ATCC27217）連續(xù)轉(zhuǎn)種3代，取第3代培養(yǎng)物接種于胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）中，在35℃±2℃的條件下培養(yǎng)20h±2h。然后用胰蛋白酶大豆肉湯適當(dāng)稀釋菌懸液，使菌懸液濃度約為108cfu/ml～109cfu/ml。2）細(xì)菌接種:在受試者的每只前臂中間部位（不要在手腕和肘皺褶處），用帶有印墨直徑為3.0cm的玻璃量筒扣在皮膚上，劃分出一個(gè)試驗(yàn)區(qū)。使用加樣器取10μl上述菌懸液，接種于前臂試驗(yàn)區(qū)（菌落數(shù)為106cfu/試驗(yàn)區(qū)～107cfu/試驗(yàn)區(qū)），用一次性接種環(huán)，把接種物涂成一圓形，使其與試驗(yàn)區(qū)邊緣應(yīng)有4mm～5mm的距離。3）封包:細(xì)菌接種后立即用小塑料碗扣于染菌區(qū)上面，再用膠帶將小塑料碗固定在皮膚上，記錄封包的時(shí)間。4）回收存活細(xì)菌：接種后2h±5min對(duì)前臂上接種的區(qū)域進(jìn)行取樣。將金屬筒放置于試驗(yàn)區(qū)中間部位，不要接觸到蓋有印墨的邊緣。將1ml含0.1%triton-X100的0.075mol/L磷酸鹽緩沖液吸移至金屬筒內(nèi)，用尼龍刮菌棒刮洗金屬筒罩住區(qū)域內(nèi)的皮膚60s，將筒內(nèi)液體吸移至試管內(nèi)，再加1ml含0.1%tritonX-100的0.075mol/L磷酸鹽緩沖液，對(duì)該區(qū)域內(nèi)的皮膚進(jìn)行第2次刮洗30s，將第2次擦洗的液體，注入含第1次刮洗液體的試管中。5）實(shí)驗(yàn)區(qū)試驗(yàn)后的消毒處理:一個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)采樣之后，需用70%的酒精對(duì)實(shí)驗(yàn)區(qū)進(jìn)行消毒。然后對(duì)另一個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)以同樣方法進(jìn)行采樣，采樣結(jié)束后，先用70%的酒精對(duì)實(shí)驗(yàn)區(qū)進(jìn)行消毒，然后用皮膚消毒劑對(duì)兩只前臂進(jìn)行消毒處理，處理后清水沖洗，擦干，再涂少量的抗生素軟膏。6）平皿接種與培養(yǎng):對(duì)每一個(gè)取樣進(jìn)行平皿接種，以0.0375mol/L磷酸鹽緩沖液對(duì)樣品進(jìn)行10倍系列稀釋，選適當(dāng)稀釋度取0.1ml接種于2個(gè)含5%羊血的TSA平板表面，用玻璃彎棒涂勻，在35℃±2℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±4h，計(jì)數(shù)菌落數(shù)。7）抑菌率的計(jì)算抑菌率=[（對(duì)照平均菌落數(shù)－試驗(yàn)平均菌落數(shù)）/對(duì)照平均菌落數(shù)]×100%5.4判定標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)不得少于16人次，抑菌率≥50%，可判定該產(chǎn)品在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)有滯留抑菌作用。5.5注意事項(xiàng)（1）受試者錄用標(biāo)準(zhǔn)①年齡介于18歲至65歲的男性或女性；②受試者應(yīng)身體健康；③前臂應(yīng)完好無損且沒有皮膚病及其它皮膚問題；④同意在整個(gè)試驗(yàn)期間，避免使用抗（抑）菌洗液和乳膏、局部類固醇類藥和全身或局部使用抗生素，除非因?yàn)椴l(fā)病癥醫(yī)生要求使用；⑤同意在清洗階段使用非藥物香皂或洗液洗澡和淋浴，但受試者不能清洗前臂。在第9次洗完前臂以后，不洗澡，淋浴或洗凈前臂，直到試驗(yàn)結(jié)束。（2）排除受試者的標(biāo)準(zhǔn)如果受試者有下列情況之一，不能被錄用參加試驗(yàn)①同時(shí)參加另外一個(gè)臨床試驗(yàn)②在過去的14d中，參加過任何一種形式的關(guān)于清潔手或手臂的試驗(yàn)③對(duì)香皂、去污劑、香水或青霉素過敏④懷孕婦女⑤診斷患有糖尿病、肝炎、艾滋?。℉IV陽性）、器官移植者，（3）其它試驗(yàn)限制①受試者不得使用其它清潔用品；②受試者應(yīng)避免洗熱水盆浴和游泳；③受試者應(yīng)避免接觸未干的油漆、涂料或者其它溶劑；④受試者應(yīng)避免在手腕處和前臂上噴灑香水。（4）在試驗(yàn)完成后的48h～72h內(nèi)，需檢查前臂上有無小膿皰、水皰，隆起的紅色癢皰。出現(xiàn)這些情況的受試者應(yīng)盡快通知檢驗(yàn)單位。6洗衣粉抗（抑）菌效果鑒定方法8（抑）1.5%）營(yíng)養(yǎng)瓊脂A：在營(yíng)養(yǎng)瓊脂中另加入1.5%的瓊脂。TSA營(yíng)養(yǎng)肉湯。Tergitol(12)不銹鋼轉(zhuǎn)軸（由一條直徑0.16cm不銹鋼絲制成，如圖2-2）俯視圖側(cè)面圖圖2-2纏繞測(cè)試布條的不銹鋼轉(zhuǎn)軸棉布（32支紗/cm×32支紗/cm平織棉布）第四天，用5mlPBS洗脫斜面上的菌苔，取0.5ml加入到含9.5mlPBS的試管中，混勻，取1ml～2ml加入含有20ml營(yíng)養(yǎng)瓊脂B的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使菌液覆蓋整個(gè)瓊脂表面。吸棄多余菌液，然后將培養(yǎng)瓶倒置平放在35℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h。用5mlPBS和3g滅菌玻璃珠洗脫細(xì)胞瓶中的菌體，用PBS調(diào)整濃度至1×108cfu/ml～5×108cfu/ml，然后加入3%的牛血清白蛋白。（4）染菌載體的制備：每片載體接種20μl菌懸液，放回培養(yǎng)皿中，加蓋，于35℃symbol177\f"Symbol"\s112℃在培養(yǎng)箱中干燥20min。（5）測(cè)試樣品的制備：至少在實(shí)驗(yàn)開始前20min，將盛有265ml硬水的玻璃罐在水浴箱中恒溫至測(cè)試溫度(25℃symbol177\f"Symbol"\s111℃)。加入被測(cè)試樣品混合溶解。6.4試驗(yàn)步驟（1）將兩片染菌載體放入轉(zhuǎn)動(dòng)支架的第6和7層布條之間，將第3片放入第7和8層布條之間。（3）玻（4）以無菌操作方式，取出轉(zhuǎn)動(dòng)單元，取出3片染菌載體，放入到含有30ml中和劑（在測(cè)試抗菌產(chǎn)品的抗菌作用時(shí)，不加中和劑，只加入含0.5%吐溫80的PBS）的試管中，在振蕩器中混合10s。然后振打200次，用PBS做10倍系列稀釋，并選擇適宜稀釋度樣液接種TSA平板。每個(gè)稀釋度接種兩個(gè)平板。3.006.6注意事項(xiàng)（1）將旋轉(zhuǎn)單元放入玻璃罐后應(yīng)將蓋子蓋緊，以防轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)漏水。（2）試驗(yàn)時(shí)應(yīng)嚴(yán)格無菌操作，以防止雜菌污染。7振蕩燒瓶試驗(yàn)7.1 原理在液體中通過快速長(zhǎng)時(shí)間振蕩，增加微生物與抗（抑）菌產(chǎn)品內(nèi)抑菌劑的接觸以顯示其抑菌作用。試驗(yàn)根據(jù)抑菌率大小判斷其是否具有抑菌能力。本試驗(yàn)適用于對(duì)非溶出性抗（抑）菌織物的鑒定。7.2 試驗(yàn)器材(1)金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、大腸桿菌(8099)、白色念珠菌(ATCC10231)菌懸液的制備方法見2.1.1.2。根據(jù)抑菌劑特定用途也可用其他菌懸液。(2)磷酸鹽緩沖液(PBS，0.03mol/L，pH值7.2～7.4)(3)振蕩搖床(300r/min)(4)三角燒瓶(5)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、與沙堡瓊脂培養(yǎng)基7.3操作程序（1）將抗菌物品剪切成10mm×10mm樣片，稱取0.75g分裝包好。（2）將0.75g樣片放入250ml的三角燒瓶中，分別加入70mlPBS和5ml菌懸液，使菌懸液在PBS中的濃度為1×104cfu/ml～5×104cfu/ml。（3）將三角燒瓶固定于振蕩搖床上，在作用溫度為20℃～25℃的條件下，以300r/min振搖2min。吸取1.0ml用PBS作適當(dāng)稀釋只至10-2，作為試驗(yàn)組震蕩前樣液。（4）將0.75g樣片放入上述含有70mlPBS和5ml菌懸液的三角燒瓶中，然后將三角燒瓶固定于振蕩搖床上，在作用溫度為20℃～25℃的條件下，以300r/min振搖取0.5ml振搖1h。吸取1.0ml樣液，或用PBS作適當(dāng)稀釋后作為試驗(yàn)組振蕩后樣液。（5）分別吸取振蕩前和振蕩后樣液各1.0ml，以瓊脂傾注法接種平皿，每個(gè)樣液接種兩個(gè)平皿，按照2.1.1.3規(guī)定的方法進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（6）試驗(yàn)同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照樣片和不加樣片組。對(duì)照樣片組以不含抗菌劑的材質(zhì)、大小相同的樣片代替抗菌樣片外，其它操作程序均與試驗(yàn)組相同。不加樣片組分別取5ml菌懸液和70mlPBS加入250ml三角燒瓶中，混勻，分別于振蕩前和振蕩后1h，各取1.0ml菌懸液與PBS的混合液做適當(dāng)稀釋。按2.1.1.2.3法進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（7）試驗(yàn)重復(fù)3次，按下列公式計(jì)算抑菌率2.1.7.7.4評(píng)價(jià)規(guī)定(1)不加樣片組活菌計(jì)數(shù)在1×104cfu/ml～5×104cfu/ml，且樣本振蕩前后平均菌落數(shù)差值在10%以內(nèi)，試驗(yàn)有效。(2)試驗(yàn)樣片抑菌率與對(duì)照樣片抑菌率的差值>26%，即可認(rèn)定該樣片具有抗菌作用。7.5 注意事項(xiàng)振蕩前須將振蕩搖床上的三角燒瓶固定牢，以免碰破。試驗(yàn)中，在實(shí)驗(yàn)誤差允許的范圍內(nèi)，如果試驗(yàn)組和對(duì)照組出現(xiàn)振蕩后菌落數(shù)高于振蕩前菌落數(shù)的情況，其抑菌率可按“0”計(jì)算。8浸漬試驗(yàn)8.1原理將試樣和對(duì)照織物分別放于三角瓶中，用含有肉湯培養(yǎng)基的試驗(yàn)菌懸液接種于試樣和對(duì)照織物上，經(jīng)培養(yǎng)后，分別將培養(yǎng)前后試樣上的細(xì)菌洗下，測(cè)定細(xì)菌的數(shù)量，可計(jì)算出試樣上細(xì)菌減少的百分率。該方法適用于溶出性抗菌織物的檢測(cè)。8.2試驗(yàn)器材(1)試驗(yàn)菌株金黃色葡萄球菌ATCC6538(2)試樣將抗菌織物剪成直徑為5cm的圓形樣片(3)肉湯培養(yǎng)基(4)胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(5)0.03mol/L磷酸鹽緩沖液pH7.2(6)恒溫水浴箱(7)37℃培養(yǎng)箱8.3試樣和菌懸液的制備（1）試樣的制備：距布邊10cm以上，離布端1m以上，剪直徑為5cm的圓形試樣若干，（需用試樣數(shù)量要根據(jù)纖維類別及織物織法而定，以能吸收1ml菌液且三角瓶中不留殘液為度）。另剪取對(duì)照織物若干，取3份試樣和2份對(duì)照織物分別裝于三角瓶中，該好瓶口，121℃15min滅菌備用。(2)菌懸液的制備用接種環(huán)將保存的菌種以劃線法接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿上，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，取平皿上典型的菌落移種到肉湯培養(yǎng)基的三角瓶中，在37℃條件下培養(yǎng)24h，用肉湯進(jìn)行系列稀釋，使菌懸液的含量為1×105cfu/ml～5×105cfu/ml。8.4試驗(yàn)步驟(1)分別取1ml菌懸液加在三個(gè)準(zhǔn)備好的三角瓶?jī)?nèi)的織物上，確保其均勻分布，且三角瓶中不留多余液，封好瓶口，以防蒸發(fā)。(2)分別在一個(gè)盛有試樣和對(duì)照織物的三角瓶中加入100ml緩沖液，劇烈搖晃1min洗滌細(xì)菌，取1ml做10倍系列稀釋，選適當(dāng)稀釋度以傾注法接種平皿，作為“0”接觸時(shí)間樣品和對(duì)照織物上的細(xì)菌數(shù)。(3)將另一個(gè)裝有接種試樣的三角瓶在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h±2h，然后加入100ml緩沖液，劇烈搖晃1min洗滌細(xì)菌，取1ml做10倍系列稀釋，選適當(dāng)稀釋度以傾注法接種平皿，作為試驗(yàn)組。(4)陰性對(duì)照試樣不接種菌懸液，在“0”接觸時(shí)間加入100ml緩沖液，劇烈搖晃1min取樣，接種平皿。(5)陽性對(duì)照另取1個(gè)裝有對(duì)照織物的三角燒瓶，接種1ml菌懸液后，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h±2h，然后加入100ml緩沖液，劇烈搖晃1min洗滌細(xì)菌，取1ml做10倍系列稀釋，選適當(dāng)稀釋度以傾注法接種平皿。(6)將陰性和陽性對(duì)照樣本與試驗(yàn)組樣本一并放入37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)菌落數(shù)。(7)試驗(yàn)重復(fù)3次。(8)結(jié)果計(jì)算B或C或(B＋C)/2-A抑菌率（%）=×100B或C或(B＋C)/2試驗(yàn)組試樣上的細(xì)菌數(shù)；“0”接觸時(shí)間試樣上的細(xì)菌數(shù)；“0”接觸時(shí)間對(duì)照織物上的細(xì)菌數(shù)；如果“B”和“C”差別較大時(shí)，取較大值；如果“B”和“C”差別不大時(shí)，取平均值。8.5評(píng)判規(guī)定（1）“0”接觸時(shí)間對(duì)照織物的平均菌落數(shù)應(yīng)在1×103cfu/ml～5×103cfu/ml。（2）陰性對(duì)照應(yīng)無菌生