茶多酚對d-半乳糖誘導(dǎo)大鼠腎臟損害的保護作用

茶多酚對d-半乳糖誘導(dǎo)大鼠腎臟損害的保護作用

茶多酚（tp）是羥基酚類化合物的總稱，具有高效的抗逆性。茶多酚主要含有5種活性單體,其中沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechingallate,EGCG)含量和活性較高,是茶多酚生物學(xué)活性的主要成分。研究表明茶多酚能抑制晶體中晚期糖基化終末產(chǎn)物(advancedglycationendproducts,AGEs)形成過程中的限速酶―醛糖還原酶(aldosereductase,AR)的活性,提示其抑制糖基化作用。本室前期工作采用D-半乳糖建立糖基化動物模型,探討了茶多酚和部分藥物對糖基化的抑制作用及對眼和腦的保護作用。本研究通過該糖基化動物模型,探討茶多酚對糖基化性腎臟損傷的保護作用及其可能的作用機制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1動物6w齡清潔級SD大鼠56只,雌雄各半,喂標(biāo)準(zhǔn)飼料,廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。1.1.3化學(xué)試劑及試劑鹽酸氨基胍(aminoguanidinehydrochloride,AG和維生素E(VE)(Sigma公司);D-半乳糖(D-gal,上海源聚生物科技公司);茶多酚(TP,純度98%,浙江東方茶葉科技公司);還原型輔酶Ⅱ(Sigma公司);DL-甘油醛(上海國藥集團化學(xué)試劑公司);糖化血紅蛋白(glycatedhemoglobin,HbAlc)、考馬斯亮藍(Coomassiebrilliantblue,CBB)測蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二酫(MDA)、谷胱甘肽氧化物酶(GSH-Px)、血尿素氮、血肌酐、羥脯氨酸、尿蛋白檢測試劑盒,均為南京建成生物工程研究所提供;果糖胺(fructosamine,FRA)試劑盒(四川邁克科技公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2各組大鼠性別和體重均隨機分級模型的建立動物分組及給藥:SD大鼠56只,按性別和體重均衡隨機8只作為正常對照組(control),腹膜內(nèi)注射(ip)生理鹽水,持續(xù)8w;其余動物均ip5%D-半乳糖(150mg/kgbw),持續(xù)8w。于第2w末,按大鼠性別和體重均衡隨機分模型組(model)、AG組(150mg/kgbw)和VE組(150mg/kgbw),茶多酚高(TP-H)、中(TP-M)、低(TP-L)劑量(150、75、37.5mg/kgbw)組。第3w開始灌胃(ig)給于上述藥,正常對照組和模型組均ig給予蒸餾水,ig容積為10ml/kgbw,連續(xù)給藥6w。動物于第8w末,3%戊巴比妥鈉(40mg/kgbw)麻醉,腹主動脈插管取血樣品進行檢測,同時取腎臟組織和分離腎細胞進行檢測。1.3觀測指標(biāo)1.3.1空腹血糖檢測大鼠空腹血糖大鼠禁食12h,尾靜脈采血0.05ml(1滴),用血糖儀以葡萄糖氧化酶法測定大鼠空腹血糖(0hBG);然后ig50%葡萄糖溶液(10g/kg),取血測2h血糖(2hBG)。1.3.2熒光光度和蛋白質(zhì)濃度測定將血液離心,取上清液0.2ml,蒸餾水稀釋2ml,RF-5000型熒光分光光度計測定熒光值,激發(fā)光和發(fā)射光波長分別為340nm和456nm;CBB法測定稀釋液的蛋白質(zhì)濃度;用U/mgprot表示血漿AGEs水平。1.3.3dl-甘油醛-dh-ro大鼠禁食12h,采血1ml,加入冰水浴中預(yù)冷的肝素抗凝管中,離心3000r/min,10min。紅細胞層以10倍體積的等滲冷鹽水沖洗3次,棄上清,加4倍體積10mmol/L的磷酸鉀緩沖液(pH6.0),振蕩10min,使之完全溶血。然后溶血液以10000r/min,離心30min(4℃),以除去細胞有形成分。AR活性測定反應(yīng)體系包括:67mmol/L鈉-鉀磷酸緩沖液(pH7.0),0.2mol/L硫酸胺,0.1mmol/LNADPH,10mmol/LDL-甘油醛和紅細胞溶血液5μl,總?cè)莘e1ml(pH6.5)。試驗管加上述所有試劑,空白管以雙蒸水代替DL-甘油醛。AR活性測定以加底物DL-甘油醛為始動,待加入底物后反應(yīng)體系移入37℃水浴中開始反應(yīng),5min后放回冰水浴,加0.3mmol/LNaOH2ml終止反應(yīng),混勻冷卻后60℃加熱15min。再加11.8mmol/LNaOH3ml,充分混勻,37℃保溫60min,于367~455nm波長測相對熒光強度,再從事先繪制的NADPH熒光測定工作曲線上讀出NADPH含量。1μmol/minNADPH被氧化的酶量為一個酶活性單位(U),紅細胞AR活性單位用U/(g/Hb·min)表示。1.3.4hba1c和fra的測量HbA1c測定采用TBA(硫代巴比妥酸)比色法,FRA測定采用NBT(硝基四氮唑藍)比色法,均按試劑盒說明書操作。1.3.5熒光強度測定將腎皮質(zhì)剪碎,加PBS(pH7.4)4ml,于4℃6000r/min,離心30min。沉淀物用去離子水洗3次,加氯仿/甲醇(2:1)5ml,4℃振蕩過夜。加入2ml甲醇及0.5ml水,離心。沉淀物用甲醇洗3次,去離子水洗3次,再用0.02mol/L的HEPES緩沖液(pH7.5,0.1mol/LCaCl2)洗2次,沉淀物于5mlHEPES緩沖液中4℃過夜。離心去除緩沖液,將沉淀物懸浮于1.0ml包含Ⅴ型膠原酶(290U)的HEPES緩沖液,加防腐劑(甲苯、氯仿2μl)。以含HEPES緩沖液及膠原酶作為空白標(biāo)準(zhǔn)管,37℃振蕩消化24h。3000r/min離心3min,留取上清消化液。于消化液中加蒸餾水1ml,避光靜置1h。用熒光分光光度計在370~440nm(發(fā)射波長/激發(fā)波長)處測定其熒光強度。用試劑盒測定消化液中羥脯氨酸含量。AGEs含量以每毫克羥脯氨酸所含的熒光強度作為一個任意單位(arbitraryunit),用AU表示。1.3.6測定了白色尿、素氮和血液肌酸的含量留取大鼠24h尿液,用CBB法測其蛋白含量;取血清,用二乙酰-肟法測其尿素氮含量,用苦味酸法測其肌酐含量。均按試劑盒說明書進行。1.3.7gsh-px含量測定取腎組織,制備勻漿,4℃保存?zhèn)溆?。采用羥胺法測定SOD,比色法測定GSH-Px,硫代巴比妥酸法測MDA含量,上述操作均嚴格按試劑盒說明書進行。1.4統(tǒng)計分析采用SPSS13.0統(tǒng)計分析,測定結(jié)果以表示,多組比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用t檢驗,顯著性水平a=0.05。2結(jié)果2.1兩組h血糖水平比較D-gal處理8w后,糖耐量試驗?zāi)Ｐ徒M2h血糖水平明顯高于正常組(P<0.01);TP高、中劑量組、AG組和VE組,明顯低于模型組(P<0.01,P<0.05)。2.2fra及tables含量比較D-gal處理8w后,模型組紅細胞AR活性、HbAlc、血清FRA及AGEs含量均明顯高于正常對照組(P<0.01);TP高、中劑量和AG處理后,可顯著降低模型組紅細胞AR活性、HbAlc、血清FRA及AGEs含量(P<0.01或P<0.05)。2.3sod和gsh-px活性D-gal處理8w后,模型組腎組織MDA含量明顯高于正常對照組,SOD和GSH-Px活性明顯低于正常對照組(P<0.01,P<0.05);TP高、中劑量及AG和VE處理后,與模型組比明顯升高SOD和GSH-Px活性,降低MDA含量(P<0.01,P<0.05)。2.4正常組與正常組比較D-gal處理8w后,模型組尿蛋白、血尿素氮和血肌酐含量明顯高于正常組(P<0.01,P<0.05);TP高、中劑量和AG處理后,明顯降低模型組尿蛋白、血尿素氮和血肌酐含量(P<0.01,P<0.05),而VE組僅降低尿蛋白含量(P<0.05)。2.5兩組含量比較D-gal處理8w后,模型組腎組織AGEs含量明顯高于正常組(P<0.01);TP高、中劑量及AG和VE處理后,明顯降低模型組AGEs含量(P<0.01,P<0.05)。2.6tp對小鼠腎細胞凋亡的影響D-gal處理8w后,模型組腎細胞凋亡率明顯高于正常組(P<0.01),TP高、中劑量及AG和VE處理后,明顯抑制模型組腎細胞凋亡率(P<0.01)。3茶多酚對d-gal誘導(dǎo)的臟器糖凝血指標(biāo)的影響蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)形成穩(wěn)定的AGEs通過交聯(lián)形成大分子物質(zhì),這些物質(zhì)可以沉積在腦和腎臟組織,導(dǎo)致這些器官組織病變損傷,此過程與糖尿病性腎病的發(fā)生密切相關(guān)。D-半乳糖(D-gal)是一種小分子還原糖性單糖,當(dāng)體內(nèi)存在過量D-gal時,它可與蛋白質(zhì)、多肽和脂類等的自由氨基發(fā)生非酶糖基化(nonenzymaticglycosation,NEG)反應(yīng),生成AGEs。過多的AGEs在腎小球系膜和毛細血管部位沉積,使腎小球體積增大,腎小球系膜膨大,基底膜增厚,使腎小球硬化。同時AGEs又可引起細胞外基質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及組成改變,如Ⅳ型膠原分子、層粘連蛋白、軟骨素(HS-PG)等,使腎小球基底膜支架結(jié)構(gòu)孔徑增大,通透性增高,造成蛋白尿和糖尿病腎病。AGEs的自氧化及與細胞膜上AGEs受體(RAGE)結(jié)合,又可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量活性氧(ROS),后者干擾細胞線粒體的功能,導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣增多和氧化應(yīng)激水平升高,并誘導(dǎo)細胞凋亡。本實驗結(jié)果可見,D-gal處理大鼠8w后,糖耐量試驗中,模型組較正常組2hBG顯著身高,提示模型組大鼠存在糖耐量異常,糖基化反應(yīng)明顯增強,表現(xiàn)為全身和腎臟AR活性和AGEs明顯增強;而抗氧化能力降低,如SOD、GSH-Px活性降低,而氧化產(chǎn)物MDA含量增加,腎細胞出現(xiàn)明顯的凋亡,表現(xiàn)為糖基化反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷同時存在,并出現(xiàn)尿蛋白,血尿素氮和血肌酐水平也明顯增加,表明腎臟功能出現(xiàn)一定程度的損傷。TP是茶葉中兒茶素類物質(zhì),主要包含表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表沒食子酰兒茶素(EGC)、沒食子兒茶素(GC)、和表兒茶素(EC)等活性物質(zhì)。研究表明,TP有明顯的抗氧化作用,能夠有效地清除氧自由基,減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生,并可經(jīng)消化道吸收,進入全身各種組織,在體內(nèi)分布非常廣泛,包括腎組織;此外,TP還具有明顯的抗腫瘤,抑制動脈粥樣硬化等作用。Ahn等研究證明EGCG能夠通過影響基因表達、細胞周期進展和促進凋亡等方式,在體外抑制子宮頸癌細胞生長。實驗結(jié)果可見,與模型組比,TP組糖耐量試驗2hBG明顯降低,全身和腎臟AR活性和AGEs明顯減弱,抑制模型動物全身糖基化反應(yīng)。同時,明顯抑制腎臟組織AGEs的生成,減輕AGEs對腎臟組織損傷作用,同時提高腎臟組織SOD、GSH-Px活性,降低MDA含量,表現(xiàn)為提高抗氧化能力和抑制腎細胞凋亡。兩者共同作用的結(jié)果,減少尿蛋白,降低血尿素氮和血肌酐水平,對腎臟提供保護作用。由此可見,茶多酚對D-gal誘致的腎臟損傷作用保護作用與其抑制糖基化反應(yīng)和提高抗氧化作用有關(guān)。茶多酚同時具有誘導(dǎo)細胞凋亡,和對D-gal誘致腎臟損傷保護作用,可能與其作用劑量有關(guān)。1.1.2高速冷凍離心儀和tu-400紫外-可見分光光度計血糖儀及試紙(美國Lifescan公司);TGL-16G型高速冷凍離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);TU-1800紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器公司);FACSCalibur型流式細胞儀(美國BectonDickinson公司)。1.3.8懸浮細胞制備取腎皮質(zhì)于1mlHank,s液中剪碎,加0.125%胰酶200μl,37℃恒溫水浴15min,攪拌消化;再加DMEM(10%小牛血