茶多酚對(duì)d-半乳糖誘導(dǎo)大鼠腎臟損害的保護(hù)作用

茶多酚對(duì)d-半乳糖誘導(dǎo)大鼠腎臟損害的保護(hù)作用

茶多酚（tp）是羥基酚類化合物的總稱，具有高效的抗逆性。茶多酚主要含有5種活性單體,其中沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechingallate,EGCG)含量和活性較高,是茶多酚生物學(xué)活性的主要成分。研究表明茶多酚能抑制晶體中晚期糖基化終末產(chǎn)物(advancedglycationendproducts,AGEs)形成過(guò)程中的限速酶―醛糖還原酶(aldosereductase,AR)的活性,提示其抑制糖基化作用。本室前期工作采用D-半乳糖建立糖基化動(dòng)物模型,探討了茶多酚和部分藥物對(duì)糖基化的抑制作用及對(duì)眼和腦的保護(hù)作用。本研究通過(guò)該糖基化動(dòng)物模型,探討茶多酚對(duì)糖基化性腎臟損傷的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1動(dòng)物6w齡清潔級(jí)SD大鼠56只,雌雄各半,喂標(biāo)準(zhǔn)飼料,廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.1.3化學(xué)試劑及試劑鹽酸氨基胍(aminoguanidinehydrochloride,AG和維生素E(VE)(Sigma公司);D-半乳糖(D-gal,上海源聚生物科技公司);茶多酚(TP,純度98%,浙江東方茶葉科技公司);還原型輔酶Ⅱ(Sigma公司);DL-甘油醛(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司);糖化血紅蛋白(glycatedhemoglobin,HbAlc)、考馬斯亮藍(lán)(Coomassiebrilliantblue,CBB)測(cè)蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二酫(MDA)、谷胱甘肽氧化物酶(GSH-Px)、血尿素氮、血肌酐、羥脯氨酸、尿蛋白檢測(cè)試劑盒,均為南京建成生物工程研究所提供;果糖胺(fructosamine,FRA)試劑盒(四川邁克科技公司);其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.2各組大鼠性別和體重均隨機(jī)分級(jí)模型的建立動(dòng)物分組及給藥:SD大鼠56只,按性別和體重均衡隨機(jī)8只作為正常對(duì)照組(control),腹膜內(nèi)注射(ip)生理鹽水,持續(xù)8w;其余動(dòng)物均ip5%D-半乳糖(150mg/kgbw),持續(xù)8w。于第2w末,按大鼠性別和體重均衡隨機(jī)分模型組(model)、AG組(150mg/kgbw)和VE組(150mg/kgbw),茶多酚高(TP-H)、中(TP-M)、低(TP-L)劑量(150、75、37.5mg/kgbw)組。第3w開(kāi)始灌胃(ig)給于上述藥,正常對(duì)照組和模型組均ig給予蒸餾水,ig容積為10ml/kgbw,連續(xù)給藥6w。動(dòng)物于第8w末,3%戊巴比妥鈉(40mg/kgbw)麻醉,腹主動(dòng)脈插管取血樣品進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)取腎臟組織和分離腎細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。1.3觀測(cè)指標(biāo)1.3.1空腹血糖檢測(cè)大鼠空腹血糖大鼠禁食12h,尾靜脈采血0.05ml(1滴),用血糖儀以葡萄糖氧化酶法測(cè)定大鼠空腹血糖(0hBG);然后ig50%葡萄糖溶液(10g/kg),取血測(cè)2h血糖(2hBG)。1.3.2熒光光度和蛋白質(zhì)濃度測(cè)定將血液離心,取上清液0.2ml,蒸餾水稀釋2ml,RF-5000型熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光值,激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為340nm和456nm;CBB法測(cè)定稀釋液的蛋白質(zhì)濃度;用U/mgprot表示血漿AGEs水平。1.3.3dl-甘油醛-dh-ro大鼠禁食12h,采血1ml,加入冰水浴中預(yù)冷的肝素抗凝管中,離心3000r/min,10min。紅細(xì)胞層以10倍體積的等滲冷鹽水沖洗3次,棄上清,加4倍體積10mmol/L的磷酸鉀緩沖液(pH6.0),振蕩10min,使之完全溶血。然后溶血液以10000r/min,離心30min(4℃),以除去細(xì)胞有形成分。AR活性測(cè)定反應(yīng)體系包括:67mmol/L鈉-鉀磷酸緩沖液(pH7.0),0.2mol/L硫酸胺,0.1mmol/LNADPH,10mmol/LDL-甘油醛和紅細(xì)胞溶血液5μl,總?cè)莘e1ml(pH6.5)。試驗(yàn)管加上述所有試劑,空白管以雙蒸水代替DL-甘油醛。AR活性測(cè)定以加底物DL-甘油醛為始動(dòng),待加入底物后反應(yīng)體系移入37℃水浴中開(kāi)始反應(yīng),5min后放回冰水浴,加0.3mmol/LNaOH2ml終止反應(yīng),混勻冷卻后60℃加熱15min。再加11.8mmol/LNaOH3ml,充分混勻,37℃保溫60min,于367~455nm波長(zhǎng)測(cè)相對(duì)熒光強(qiáng)度,再?gòu)氖孪壤L制的NADPH熒光測(cè)定工作曲線上讀出NADPH含量。1μmol/minNADPH被氧化的酶量為一個(gè)酶活性單位(U),紅細(xì)胞AR活性單位用U/(g/Hb·min)表示。1.3.4hba1c和fra的測(cè)量HbA1c測(cè)定采用TBA(硫代巴比妥酸)比色法,FRA測(cè)定采用NBT(硝基四氮唑藍(lán))比色法,均按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。1.3.5熒光強(qiáng)度測(cè)定將腎皮質(zhì)剪碎,加PBS(pH7.4)4ml,于4℃6000r/min,離心30min。沉淀物用去離子水洗3次,加氯仿/甲醇(2:1)5ml,4℃振蕩過(guò)夜。加入2ml甲醇及0.5ml水,離心。沉淀物用甲醇洗3次,去離子水洗3次,再用0.02mol/L的HEPES緩沖液(pH7.5,0.1mol/LCaCl2)洗2次,沉淀物于5mlHEPES緩沖液中4℃過(guò)夜。離心去除緩沖液,將沉淀物懸浮于1.0ml包含Ⅴ型膠原酶(290U)的HEPES緩沖液,加防腐劑(甲苯、氯仿2μl)。以含HEPES緩沖液及膠原酶作為空白標(biāo)準(zhǔn)管,37℃振蕩消化24h。3000r/min離心3min,留取上清消化液。于消化液中加蒸餾水1ml,避光靜置1h。用熒光分光光度計(jì)在370~440nm(發(fā)射波長(zhǎng)/激發(fā)波長(zhǎng))處測(cè)定其熒光強(qiáng)度。用試劑盒測(cè)定消化液中羥脯氨酸含量。AGEs含量以每毫克羥脯氨酸所含的熒光強(qiáng)度作為一個(gè)任意單位(arbitraryunit),用AU表示。1.3.6測(cè)定了白色尿、素氮和血液肌酸的含量留取大鼠24h尿液,用CBB法測(cè)其蛋白含量;取血清,用二乙酰-肟法測(cè)其尿素氮含量,用苦味酸法測(cè)其肌酐含量。均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。1.3.7gsh-px含量測(cè)定取腎組織,制備勻漿,4℃保存?zhèn)溆谩２捎昧u胺法測(cè)定SOD,比色法測(cè)定GSH-Px,硫代巴比妥酸法測(cè)MDA含量,上述操作均嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。1.4統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析,測(cè)定結(jié)果以表示,多組比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用t檢驗(yàn),顯著性水平a=0.05。2結(jié)果2.1兩組h血糖水平比較D-gal處理8w后,糖耐量試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M2h血糖水平明顯高于正常組(P<0.01);TP高、中劑量組、AG組和VE組,明顯低于模型組(P<0.01,P<0.05)。2.2fra及tables含量比較D-gal處理8w后,模型組紅細(xì)胞AR活性、HbAlc、血清FRA及AGEs含量均明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01);TP高、中劑量和AG處理后,可顯著降低模型組紅細(xì)胞AR活性、HbAlc、血清FRA及AGEs含量(P<0.01或P<0.05)。2.3sod和gsh-px活性D-gal處理8w后,模型組腎組織MDA含量明顯高于正常對(duì)照組,SOD和GSH-Px活性明顯低于正常對(duì)照組(P<0.01,P<0.05);TP高、中劑量及AG和VE處理后,與模型組比明顯升高SOD和GSH-Px活性,降低MDA含量(P<0.01,P<0.05)。2.4正常組與正常組比較D-gal處理8w后,模型組尿蛋白、血尿素氮和血肌酐含量明顯高于正常組(P<0.01,P<0.05);TP高、中劑量和AG處理后,明顯降低模型組尿蛋白、血尿素氮和血肌酐含量(P<0.01,P<0.05),而VE組僅降低尿蛋白含量(P<0.05)。2.5兩組含量比較D-gal處理8w后,模型組腎組織AGEs含量明顯高于正常組(P<0.01);TP高、中劑量及AG和VE處理后,明顯降低模型組AGEs含量(P<0.01,P<0.05)。2.6tp對(duì)小鼠腎細(xì)胞凋亡的影響D-gal處理8w后,模型組腎細(xì)胞凋亡率明顯高于正常組(P<0.01),TP高、中劑量及AG和VE處理后,明顯抑制模型組腎細(xì)胞凋亡率(P<0.01)。3茶多酚對(duì)d-gal誘導(dǎo)的臟器糖凝血指標(biāo)的影響蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)形成穩(wěn)定的AGEs通過(guò)交聯(lián)形成大分子物質(zhì),這些物質(zhì)可以沉積在腦和腎臟組織,導(dǎo)致這些器官組織病變損傷,此過(guò)程與糖尿病性腎病的發(fā)生密切相關(guān)。D-半乳糖(D-gal)是一種小分子還原糖性單糖,當(dāng)體內(nèi)存在過(guò)量D-gal時(shí),它可與蛋白質(zhì)、多肽和脂類等的自由氨基發(fā)生非酶糖基化(nonenzymaticglycosation,NEG)反應(yīng),生成AGEs。過(guò)多的AGEs在腎小球系膜和毛細(xì)血管部位沉積,使腎小球體積增大,腎小球系膜膨大,基底膜增厚,使腎小球硬化。同時(shí)AGEs又可引起細(xì)胞外基質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及組成改變,如Ⅳ型膠原分子、層粘連蛋白、軟骨素(HS-PG)等,使腎小球基底膜支架結(jié)構(gòu)孔徑增大,通透性增高,造成蛋白尿和糖尿病腎病。AGEs的自氧化及與細(xì)胞膜上AGEs受體(RAGE)結(jié)合,又可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量活性氧(ROS),后者干擾細(xì)胞線粒體的功能,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣增多和氧化應(yīng)激水平升高,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn),D-gal處理大鼠8w后,糖耐量試驗(yàn)中,模型組較正常組2hBG顯著身高,提示模型組大鼠存在糖耐量異常,糖基化反應(yīng)明顯增強(qiáng),表現(xiàn)為全身和腎臟AR活性和AGEs明顯增強(qiáng);而抗氧化能力降低,如SOD、GSH-Px活性降低,而氧化產(chǎn)物MDA含量增加,腎細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡,表現(xiàn)為糖基化反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷同時(shí)存在,并出現(xiàn)尿蛋白,血尿素氮和血肌酐水平也明顯增加,表明腎臟功能出現(xiàn)一定程度的損傷。TP是茶葉中兒茶素類物質(zhì),主要包含表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)、表沒(méi)食子酰兒茶素(EGC)、沒(méi)食子兒茶素(GC)、和表兒茶素(EC)等活性物質(zhì)。研究表明,TP有明顯的抗氧化作用,能夠有效地清除氧自由基,減少脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生,并可經(jīng)消化道吸收,進(jìn)入全身各種組織,在體內(nèi)分布非常廣泛,包括腎組織;此外,TP還具有明顯的抗腫瘤,抑制動(dòng)脈粥樣硬化等作用。Ahn等研究證明EGCG能夠通過(guò)影響基因表達(dá)、細(xì)胞周期進(jìn)展和促進(jìn)凋亡等方式,在體外抑制子宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn),與模型組比,TP組糖耐量試驗(yàn)2hBG明顯降低,全身和腎臟AR活性和AGEs明顯減弱,抑制模型動(dòng)物全身糖基化反應(yīng)。同時(shí),明顯抑制腎臟組織AGEs的生成,減輕AGEs對(duì)腎臟組織損傷作用,同時(shí)提高腎臟組織SOD、GSH-Px活性,降低MDA含量,表現(xiàn)為提高抗氧化能力和抑制腎細(xì)胞凋亡。兩者共同作用的結(jié)果,減少尿蛋白,降低血尿素氮和血肌酐水平,對(duì)腎臟提供保護(hù)作用。由此可見(jiàn),茶多酚對(duì)D-gal誘致的腎臟損傷作用保護(hù)作用與其抑制糖基化反應(yīng)和提高抗氧化作用有關(guān)。茶多酚同時(shí)具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,和對(duì)D-gal誘致腎臟損傷保護(hù)作用,可能與其作用劑量有關(guān)。1.1.2高速冷凍離心儀和tu-400紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)血糖儀及試紙(美國(guó)Lifescan公司);TGL-16G型高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);TU-1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器公司);FACSCalibur型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BectonDickinson公司)。1.3.8懸浮細(xì)胞制備取腎皮質(zhì)于1mlHank,s液中剪碎,加0.125%胰酶200μl,37℃恒溫水浴15min,攪拌消化;再加DMEM(10%小牛血