plca檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

plca檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

1磷酸鹽脂肪酸分析方法100多年來(lái)，在實(shí)驗(yàn)室人工條件下，微生物分離和培養(yǎng)技術(shù)一直是研究和理解微生物生態(tài)學(xué)的基本手段，但到目前為止，已知的僅有一部分微生物存在?，F(xiàn)在只有5000多種確定的原核生物，主要原因是大多數(shù)自然界存在的微生物（有人認(rèn)為它們可能超過(guò)99%）。在目前的條件下，很難在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行人工培養(yǎng)，也無(wú)法獲得其純度培養(yǎng)，不能研究形狀、生理和遺傳的性質(zhì)。也就是說(shuō),傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)基的微生物技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)研究中有很大的局限性,培養(yǎng)基本身實(shí)際上具有一定的選擇性,且無(wú)法還原微生物的真實(shí)生境;培養(yǎng)過(guò)程是一個(gè)重新選擇的過(guò)程,存在著很多不確定性,其結(jié)果不能反映原始的群落結(jié)構(gòu)。因此,傳統(tǒng)方法只能提供微生物群落的一小部分信息,不能滿(mǎn)足微生物生態(tài)學(xué)研究的需要。近年來(lái),基于現(xiàn)代生物化學(xué)技術(shù)發(fā)展起來(lái)的磷脂脂肪酸(phospholipidfattyacid,PLFA)分析方法和傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)基的微生物分離技術(shù)以及生理學(xué)方法、分子生物學(xué)方法相比,具有以下優(yōu)點(diǎn):①PLFA不用考慮培養(yǎng)體系的影響,亦能直接有效地提供微生物群落中的信息,適合跟蹤研究微生物群落的動(dòng)態(tài)變化;②對(duì)細(xì)胞生理活性沒(méi)有特殊的要求,對(duì)樣品保存時(shí)間也要求不高,獲得的信息基本上由樣品中所有微生物提供;③脂肪酸成分不受質(zhì)粒損失或增加的影響,以及幾乎也不受有機(jī)體變化的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為客觀、可靠;④試驗(yàn)條件要求低、操作難度小、價(jià)格相對(duì)較低,并且測(cè)試功能多。因此該方法在微生物生態(tài)學(xué)的研究中得到了越來(lái)越多的應(yīng)用。磷脂是幾乎所有微生物細(xì)胞膜的重要組成部分,含量在自然生理?xiàng)l件下相對(duì)恒定,約占細(xì)胞干重的5%,不同的微生物具有不同的PLFA種類(lèi)和數(shù)量,一些脂肪酸還可能只特異性地存在于某種(類(lèi))微生物的細(xì)胞膜中,PLFA可以作為微生物生物量和群落結(jié)構(gòu)變化的生物標(biāo)記分子;磷脂在細(xì)胞死亡后迅速分解,代表了有活性的那部分細(xì)胞,適合于微生物群落的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。因?yàn)镻LFA在進(jìn)行GC-MS分析前要甲酯化生成脂肪酸甲酯(FattyAcidMethylEster,FAME),一些研究中將PLFA分析又稱(chēng)為FAME分析。2plfa在微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用2.1生物多樣性估算在微生物生態(tài)學(xué)研究中,PLFA通常被用來(lái)估算微生物生物量、確定群落結(jié)構(gòu)、指示特定微生物、指示生理和營(yíng)養(yǎng)狀況等。利用PLFA進(jìn)行這些測(cè)定的步驟見(jiàn)圖1。2.2可提取性磷脂的數(shù)量磷脂幾乎存在于所有細(xì)胞的細(xì)胞膜中,在適宜的條件下,自然界微生物群落中細(xì)菌的細(xì)胞磷脂含量和微生物量有相對(duì)穩(wěn)定的比例關(guān)系,故可根據(jù)這一點(diǎn)來(lái)確定細(xì)菌的生物量?？偟纳锪靠梢杂蓸O性磷脂水解后的磷酸鹽估算,也可以由總的PLFA量估算。利用PLFA估算生物量時(shí),涉及到一個(gè)PLFA量和生物量之間“轉(zhuǎn)換系數(shù)”的概念,經(jīng)White等研究發(fā)現(xiàn),該系數(shù)的范圍一般為2×104～6×104cell·pmol-1PLFA。轉(zhuǎn)換系數(shù)通常會(huì)受到一些因素的影響。由于分類(lèi)差異,群落構(gòu)成影響了細(xì)胞中PLFA的平均濃度,特別是在真核細(xì)胞和原核生物之間;外部一些物理?xiàng)l件(如pH、溫度、水分等)的變化會(huì)影響PLFA的濃度;在有一定深度、飽和的沉積物中,磷脂的轉(zhuǎn)化率,以及磷脂的存儲(chǔ)等都會(huì)改變轉(zhuǎn)化因子。因此,在使用PLFA估算生物量時(shí),這些潛在因素都應(yīng)加以考慮。此外,Ludvigsen等的研究還表明,用“轉(zhuǎn)換系數(shù)”估算不同樣品生物量時(shí),只適合于同一地點(diǎn)樣品間的生物量比較,而不適合不同地點(diǎn)間樣品的比較。脂肪酸濃度可用甲基十九烷脂肪酸(19:0)作為內(nèi)標(biāo)來(lái)進(jìn)行定量測(cè)定,總量用nmol·cm-3表示。海洋沉積物中微生物區(qū)系由復(fù)雜微生物群落組成,群落的結(jié)構(gòu)、功能和相互關(guān)系經(jīng)常改變,在現(xiàn)場(chǎng)條件下,用傳統(tǒng)培養(yǎng)計(jì)數(shù)法不失真地測(cè)量微生物總量非常困難。陳進(jìn)才、林慶梅等應(yīng)用GC-MS技術(shù),分析了深圳大亞灣大鵬澳及廈門(mén)島南岸海域沿岸幾個(gè)站位沉積物中可提取性磷脂酯結(jié)合態(tài)脂肪酸的含量和組成成份;同時(shí)采用丫啶橙熒光染色計(jì)數(shù)法測(cè)定了這些沉積物中細(xì)菌的豐度、生物量。結(jié)果表明,在這些沉積物中細(xì)菌的生物量與磷脂酯結(jié)合態(tài)脂肪酸的組份(nC16:0)的含量有著正相關(guān)關(guān)系。說(shuō)明在環(huán)境生態(tài)研究中,可提取性磷脂作為海洋和河口沉積物中微生物生物量的生物標(biāo)志物的可行性。Rajendran等以沉積物中PLFA濃度為基礎(chǔ),得出了富營(yíng)養(yǎng)海灣沉積物中各種可數(shù)微生物量的差異(平均標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.70×108±0.53×108cell·g-1沉積物干重),并且還發(fā)現(xiàn)廣島海灣沉積物中的生物量多于其余海灣中的生物量。由于土壤微生物群落固有的特點(diǎn),僅僅依靠傳統(tǒng)方法獲得其生物量是非常困難的。姚槐應(yīng)等用PLFA法研究了8種紅壤微生物群落,所有土壤均含有各種飽和的、不飽和的、分枝的及環(huán)狀的脂肪酸,其中試驗(yàn)鑒定了C12到C35的35種脂肪酸。磷脂脂肪酸的總量與土壤有機(jī)碳及微生物生物量碳顯著相關(guān)(相關(guān)系數(shù)分別為0.97和0.93)。Frostegard等則利用磷脂的總含量得到了不同有機(jī)成分土壤的微生物生物量。土壤的生物量會(huì)受到很多環(huán)境因素的影響,Bardgett等通過(guò)模擬的陸地自然生態(tài)系統(tǒng)(實(shí)驗(yàn)中特地減少土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)),用PLFA分析法證明了大氣溫度對(duì)陸地生態(tài)系統(tǒng)模型中土壤微生物量的影響,結(jié)果表明,大氣升溫對(duì)貧營(yíng)養(yǎng)土壤中的微生物量影響不大。2.3利用環(huán)丙基脂肪酸進(jìn)行的直接生物指示生物群落可以定義為在特定空間或特定環(huán)境下,具有一定外觀和結(jié)構(gòu)(包括形態(tài)結(jié)構(gòu)和營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)),具有特定功能的生物集合體。PLFA分析法被廣泛應(yīng)用于土壤、水體沉積物、地下水,以及與水處理相關(guān)的生物膜和菌膠團(tuán)等微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的研究中。在現(xiàn)有的研究中,PLFA一般只能粗略地區(qū)分革蘭氏陽(yáng)性、陰性菌,好氧細(xì)菌、厭氧細(xì)菌、真菌等(表1),但有時(shí)也根據(jù)具有種屬特異性的PLFA,來(lái)指示特定的微生物。例如,環(huán)丙基脂肪酸是硫酸鹽還原細(xì)菌所特有的,Ludvigsen等研究表明,硫酸還原菌數(shù)量與環(huán)丙基脂肪酸濃度明顯相關(guān),說(shuō)明了環(huán)丙基脂肪酸對(duì)硫酸還原菌的可生物指示性。Cha等用c19:1ω8,16:1ω6c,15:0ω2,14特異性指示諾卡氏菌(Nocardia),并且結(jié)合正常活性污泥的FAME圖譜,得到這些生物標(biāo)記物的相對(duì)豐度,用來(lái)確定出活性污泥膨脹的幾率。土壤微生物以其豐富的生物多樣性使它們成為生態(tài)系統(tǒng)中最活躍和最具影響力的組分之一,姚槐應(yīng)等采用PLFA分析法,研究了供試土壤微生物群落的功能多樣性和結(jié)構(gòu)多樣性,并且鑒別出了土壤微生物的組成結(jié)構(gòu),為揭示土壤質(zhì)量的演變機(jī)制和土壤的科學(xué)利用提供了理論依據(jù)。Priha等用PLFA法對(duì)某森林中松樹(shù)、云杉、樺樹(shù)下土壤進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)不同樹(shù)種下的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)明顯不同,樺樹(shù)土壤中革蘭氏陰性菌(如假單胞菌)數(shù)量很多,松樹(shù)和云杉土壤中革蘭氏陽(yáng)性菌數(shù)量則較多。因此得出結(jié)論:植被覆蓋類(lèi)型,尤其是優(yōu)勢(shì)樹(shù)種類(lèi)型對(duì)土壤生物性質(zhì)有明顯的影響。Bowman等用PLFA法研究了南極大陸架(709～964m)沉積物中的微生物群落,發(fā)現(xiàn)樣品中含有典型的深海沉積物中才有的脂類(lèi),只有極小部分與該深度不相符。然而在0～1和13～15cm的沉積物中,PLFA組分明顯不同,說(shuō)明這兩個(gè)深度微生物群落結(jié)構(gòu)有很大的不同。Rajendran等用PLFA法鑒定了富營(yíng)養(yǎng)海灣沉積物中C10到C24的63種脂肪酸,它們包括飽和的、支鏈的、單鍵不飽和的、多鍵不飽和的脂肪酸,研究發(fā)現(xiàn)沉積物中這些脂肪酸所占的相對(duì)比例是有差異的。2.4重金屬對(duì)土壤微生物的影響在受污染的地下水中,脂類(lèi)生物標(biāo)記物可以有效的顯示出微生物群落結(jié)構(gòu)的空間模型。群落結(jié)構(gòu)的變化通常和群落中氧化還原狀態(tài)有關(guān)。在污染源附近,由于電子受體的減少,通常會(huì)出現(xiàn)大量的還原性硫酸鹽,Albrechtsen等用PLFA法在污染源附近發(fā)現(xiàn)了大量的硫酸鹽還原細(xì)菌。在美國(guó)空軍基地受燃料油污染的某含水層,不同深度環(huán)丙基脂肪酸含量的改變,指示出了其中烴基及其代謝產(chǎn)物的厭氧微生物的增加。Frostegard等用PLFA法反映受重金屬污染土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。在森林腐殖土壤和耕地土壤中,分別加入不同劑量的Cd、Cu、Ni、Pb、Zn,從PLFA譜圖可見(jiàn),在兩種土壤中,污染導(dǎo)致了iso-(異構(gòu))支鏈脂肪酸i15:0、i17:0、多鍵不飽和脂肪酸16:1ω5、16:1ω7c的減少,而i16:0,支鏈br17:0、br18:0,和環(huán)丙烷cy17:0脂肪酸有所增加。在森林土壤中,甲基支鏈脂肪酸10Me16:0,10Me17:0和10Me18:0增長(zhǎng),說(shuō)明放射菌類(lèi)數(shù)量的增長(zhǎng),而在耕地土壤中,10Me16:0和10Me18:0的數(shù)量卻下降。主要在真菌中存在的18:2ω6,在除Cu以外其它金屬污染的耕地土壤中數(shù)量增加,而Cu污染使其減少。用PLFA法測(cè)定重金屬對(duì)土壤微生物的影響,Kandeler等發(fā)現(xiàn)經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間重金屬污染后,土壤中真菌/細(xì)菌的比值上升,其原因可能是真菌具有耐重金屬污染的能力,同時(shí)也發(fā)現(xiàn),在富含重金屬的淤泥和粘土中,微生物量有明顯的減少。Peterser等用PLFA法分析了不同處理方式(過(guò)篩、存儲(chǔ),以及培養(yǎng)溫度等)對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。發(fā)現(xiàn)土壤樣品經(jīng)過(guò)篩(篩孔4mm),以及培養(yǎng)3周后,盡管脂肪酸18:2ω6c指示出真菌數(shù)量減少,但總的群落結(jié)構(gòu)變化很小;同樣是經(jīng)過(guò)3周的培養(yǎng),不同的溫度對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化則有不同的影響,試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)主成分分析后,發(fā)現(xiàn)在4.5℃和10℃下,土壤中PLFA的構(gòu)成變化不大,而在25℃下,PLFA的構(gòu)成發(fā)生了顯著的變化,其中包括不飽和脂肪酸數(shù)量的減少,環(huán)丙基脂肪酸數(shù)量的增加,以及支鏈脂肪酸(iso-15:0、iso-17:0)和(anteiso-15:0、anteiso-17:0)的比值增大。該現(xiàn)象可能和微生物的溫度適應(yīng)機(jī)理或者對(duì)環(huán)境壓力的反應(yīng)有關(guān)。Bowman等往受三氯乙烯(TCE)和四氯乙烯(PCE)污染的地下水中加入25種甲烷營(yíng)養(yǎng)菌,PLFA譜圖發(fā)現(xiàn)甲烷營(yíng)養(yǎng)菌Ⅱ的生物指示物18:1ω8c占了脂肪酸總量的60%～80%,因此說(shuō)明微生物群落結(jié)構(gòu)中甲烷營(yíng)養(yǎng)菌Ⅱ?yàn)閮?yōu)勢(shì)菌,隨后的研究表明,大多數(shù)甲烷營(yíng)養(yǎng)菌表現(xiàn)出可溶性甲烷單氧酶(solublemethanemonooxygenase,sMMO)活性,并且TCE被大多數(shù)sMMO生成菌以不同的速度降解,而PCE卻未被降解。最后得出了假設(shè):通過(guò)刺激甲烷營(yíng)養(yǎng)菌群的生長(zhǎng),并且經(jīng)過(guò)sMMO的促進(jìn)作用,階烷營(yíng)養(yǎng)菌可以有效的去除地下水中的氯代脂肪類(lèi)碳?xì)浠衔铩mith等通過(guò)PLFA分析法發(fā)現(xiàn),輸水管網(wǎng)中的生物膜中革蘭氏陰性菌為優(yōu)勢(shì)菌種,其群落的結(jié)構(gòu)不隨季節(jié)的改變而改變,并且在群落中發(fā)現(xiàn)了具有環(huán)氧化物結(jié)構(gòu)的脂肪酸,說(shuō)明了消毒劑氯的存在會(huì)使微生物的活性下降。脂類(lèi)生物標(biāo)記物在確定某特定微生物群落結(jié)構(gòu)和功能中非常有用。但由于該技術(shù)的一些內(nèi)在不確定性,它通常需要其它一些技術(shù)來(lái)配合,如最大然數(shù)法(MPN)或核酸技術(shù)等,會(huì)達(dá)到相對(duì)較好的使用效果。2.5環(huán)丙基脂肪酸法在自然條件中,微生物細(xì)胞易受外界環(huán)境因素的影響,膜脂的化學(xué)組分從而改變,以適應(yīng)新的環(huán)境。因此,可以用脂類(lèi)化學(xué)物質(zhì)的變化來(lái)作為微生物的生理學(xué)指標(biāo)。根據(jù)這些生理學(xué)指標(biāo),可以定量地描述微生物所受環(huán)境壓力的程度,以及種群中“活的”那部分微生物所占的比例。細(xì)胞在毒性或饑餓壓力下,反式結(jié)構(gòu)脂肪酸/順式結(jié)構(gòu)脂肪酸(trans-/cis-)的值會(huì)升高。目前最常用的是16:1ω7和18:1ω7的trans-/cis-值。一般認(rèn)為,當(dāng)比值<0.1時(shí),細(xì)胞處于健康生長(zhǎng)狀態(tài)。同樣在饑餓壓力下,革蘭氏陰性菌會(huì)把某些單烯PLFA轉(zhuǎn)化為環(huán)丙基脂肪酸。因此環(huán)丙基脂肪酸和前體物的比值也可以用來(lái)指示微生物所處的壓力狀態(tài)。Kieft等用這兩個(gè)指標(biāo)相結(jié)合的方法分析地下水微生物群落的變化,取得了很好的效果。當(dāng)微生物生長(zhǎng)所需的碳源和能量多于其它養(yǎng)分時(shí),細(xì)胞內(nèi)就會(huì)積聚一種聚合短鏈脂肪酸PHA(多聚-β-羥基鏈烷酸脂),它是一種內(nèi)源性貯存物質(zhì)。Jain等認(rèn)為高的PHA/PLFA值即意味著生境中存在著限制性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。Smith等發(fā)現(xiàn),受雜酚油污染過(guò)的沉積物中PHA/PLFA比未污染前下降。一些PLFA在細(xì)胞死亡后會(huì)分解出甘油二酯脂肪酸(DGFA),因此,DGFA被用于細(xì)胞死亡的指示物。但由于細(xì)胞死亡率、PLFA的分解轉(zhuǎn)化率,以及DGFA的存留率等潛在因素影響,目前DGFA和死亡細(xì)胞在數(shù)量上還沒(méi)有一定的定量關(guān)系,還需對(duì)DGFA的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。由于生理學(xué)指標(biāo)和化學(xué)參數(shù)的變化緊密相聯(lián),從而反映出了微生物活性,所以生理學(xué)指標(biāo)還可以用于污染區(qū)域生物修復(fù)的研究。Ludvigsen等發(fā)現(xiàn)在垃圾填埋場(chǎng)附件出現(xiàn)低的trans-/cis-、環(huán)丙基脂肪酸/丙烯酸值,原因是滲濾液提供了微生物生長(zhǎng)所需的溶解性有機(jī)碳,促進(jìn)了微生物生長(zhǎng),從而維持了一個(gè)較均衡的生長(zhǎng)條件。3plfa算法PLFA方法也具有一定的局限性,主要表現(xiàn)為對(duì)微生物的分類(lèi)還不夠精確,只能根據(jù)某些相同生理特征分成一個(gè)大的類(lèi)群;標(biāo)記脂肪酸進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室處理時(shí),易受人為因素干擾;脂肪酸含量在不同生長(zhǎng)期,以及環(huán)境壓力下會(huì)發(fā)生變化,但目前可通過(guò)環(huán)境因素標(biāo)準(zhǔn)化來(lái)解決一些問(wèn)題。美國(guó)的MIDI公司已經(jīng)將PLFA技術(shù)商品化。常見(jiàn)的微生物PLFA譜圖,基本上都包括在