伊貝沙坦對(duì)糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激、nf-b活性和icam-1mrna表達(dá)的影響

伊貝沙坦對(duì)糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激、nf-b活性和icam-1mrna表達(dá)的影響

糖尿病性腎衰竭（dn）是糖尿病最常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一。它嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，威脅了患者的生命。其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠中,血管緊張素系統(tǒng)和氧化應(yīng)激參與了糖尿病腎臟病變的發(fā)病機(jī)制,糖尿病時(shí)高血糖使腎組織內(nèi)血管緊張素(Ang)Ⅱ增加,導(dǎo)致腎血管通透性增加,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);高血糖還可使活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)生成增加,損傷自身的抗氧化系統(tǒng),參與DN的發(fā)生。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物,SOD、CAT及GSH-PX是抗氧化的幾項(xiàng)主要指標(biāo)。研究認(rèn)為,ROS能激活核因子(NF)-κB,繼而增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄ICAM-1等多種對(duì)腎組織有損傷的介質(zhì)。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)AngⅡ受體拮抗劑伊貝沙坦可抑制ROS的增加,但是有關(guān)伊貝沙坦對(duì)NF-κB通路影響的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察伊貝沙坦對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用并探討其對(duì)糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)和NF-κB活性、ICAM-1mRNA表達(dá)水平的影響。1材料和方法1.1適應(yīng)性飼養(yǎng)時(shí)間雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠33只(廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),2月齡,體質(zhì)量110~130g,在恒溫22℃、相對(duì)濕度70%~75%、晝夜周期12h環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)2周,自由覓食與飲水。STZ(美國(guó)Sigma公司),Trizol(Invitrogen公司),DEPC(Sigma公司),TaqPlusDNA聚合酶、dNTP(上海生工),RT-PCR基礎(chǔ)試劑盒、上樣緩沖液(TaKaRa公司),伊貝沙坦(法國(guó)賽諾菲公司),尿白蛋白試劑盒(法國(guó)SPI公司),丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)以及谷胱苷肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)試劑盒(南京建成生物工程研究所),EMSA試劑盒(美國(guó)Promega公司)。1.2大鼠血糖穩(wěn)定時(shí)間模型糖尿病大鼠模型的制作:20g/LSTZ溶液,按65mg/kg腹腔注射,72h后經(jīng)尾靜脈采血測(cè)血糖(OneTouchⅡ血糖儀:美國(guó)lifescan公司)。成模標(biāo)準(zhǔn):72h后測(cè)血糖空腹血糖≥16.7mmol/L,對(duì)照組予以腹腔注射等量枸櫞酸緩沖液。糖尿病造模成功待血糖穩(wěn)定一周后,大鼠按體質(zhì)量分層隨機(jī)分組,分為對(duì)照組(C)、模型組(D)、伊貝沙坦組(I)。每組11只。用藥方案:均為強(qiáng)制性灌胃,伊貝沙坦組大鼠給予伊貝沙坦15mg/(kg·d)劑量,對(duì)照組與糖尿病組給予等量蒸餾水灌胃。所有大鼠在12周實(shí)驗(yàn)期間均喂標(biāo)準(zhǔn)飲食,自由覓水,不應(yīng)用胰島素。1.3腎組織pas染色12周末將全部大鼠置代謝籠收集24h尿液保存,測(cè)尿白蛋白。所有大鼠禁食12h后稱量體質(zhì)量,用戊巴比妥溶液40mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉,經(jīng)腹主動(dòng)脈采集血標(biāo)本測(cè)血糖水平;處死大鼠,迅速灌洗后腎臟游離,取5mm3大小腎組織,外固定,行PAS染色。剩余腎組織速置于液氮中保存,凍透后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中待測(cè)腎組織MDA含量與SOD、CAT、GSH-PX活性變化,及測(cè)ICAM-1mRNA表達(dá)及NF-κB活性。1.424h尿中微白色飼料的排泄率aeerUAER=尿白蛋白水平(μg/mL)×24h尿量(mL),尿白蛋白測(cè)定采用放射免疫法。1.5腎組織中的sda含量以及sod、cat和gsh-px活性的測(cè)定MDA用硫代巴比妥酸(TAB)法,SOD活性用黃嘌呤氧化酶法,CAT活性用化學(xué)比色法,GSH-Px活性用二硫代二硝基苯甲酸法。1.6平均小鼠體積測(cè)定采用HPIAS-1000型圖像分析系統(tǒng)對(duì)病理切片進(jìn)行分析,在400倍視野下隨機(jī)選擇皮質(zhì)區(qū)30個(gè)腎小球截面,檢測(cè)腎小球截面平均直徑(d),根據(jù)體視學(xué)公式D=4d/π計(jì)算出平均腎小球直徑(D),再根據(jù)公式V=4/3π(D/2)2計(jì)算出平均腎小球體積(meanglomerularvolume,MGV)。1.7nf-b一致性雙鏈寡核苷酸法檢測(cè)核蛋白蛋白表達(dá)按照Schreiber方法提取腎組織核蛋白:取100g腎組織,加入溶液A(mmol/L)[10N-2羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸(HEPES,pH8.0)、10KCl,1.5MgCl2,0.1乙二胺四乙酸二鈉(EDTA),1二硫蘇糖醇(DTT),0.5苯甲基磺酰氟(PMSF),美國(guó)Sigma公司],用研磨器研磨至勻漿狀,冰浴,以離心半徑15cm、10000r/min離心15s,棄上清,溶液A洗滌,以離心半徑15cm、10000r/min離心15s,棄上清。下層沉淀加入200μL預(yù)冷的溶液B(mmol/L)[20HEPES(pH8.0)、1.5MgCl2、420NaCl、0.1EDTA、1DTT、0.5PMSF,25%甘油],冰上孵育30min,以離心半徑10cm、12000r/min離心15min,取上清,即為核蛋白提取物。取少量用Bradford法測(cè)定提取物中蛋白濃度,剩余部分置于液氮中凍透后移至-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。凝膠電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行:將核蛋白提取液加入凝膠遷移結(jié)合緩沖液[10Tris-HCl(pH7.5)、4%甘油、1MgCl2、0.5DTT、0.5EDTA、50NaCl,0.05mg/mL非特異性競(jìng)爭(zhēng)DNA(poly(di-dc)]中預(yù)孵育10min,加入[γ-32P]ATP標(biāo)記的NF-κB一致性雙鏈寡核苷酸探針,室溫孵育20min,反應(yīng)體系9μL。NF-κB一致性雙鏈寡核苷酸序列:5′AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC3′。將形成的核蛋白復(fù)合物在60g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行垂直電泳放射自顯影24h。用凝膠掃描系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。1.8pcr產(chǎn)物的檢測(cè)Trizol試劑提取腎皮質(zhì)總RNA,取總RNA產(chǎn)物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。ICAM-1引物序列:上游為5’-AATGCTGACCCTGGAGAGCA-3’;下游為:5’-CCGGGACTTCCCATCCAGCA-3’。內(nèi)參照β-actin引物序列:上游為5’-ACGTGCGTGACATTAAAGTC-3’,下游為5’-TGCGGATAGAGCCACCAATC-3’。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性,94℃變性,55℃退火,72℃延伸,共30循環(huán)。所有循環(huán)最后均72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物在10g/L瓊脂糖凝膠(EB染色)上電泳檢測(cè),以Marker為分子大小標(biāo)記,在紫外燈下觀察并照相,在圖像分析系統(tǒng)上進(jìn)行密度掃描。以β-actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物的密度比較,表示ICAM-1mRNA的表達(dá)水平。1.9統(tǒng)計(jì)分析計(jì)量數(shù)據(jù)以表示,應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,組間差異性比較用t檢驗(yàn)及單因素方差分析,P<0.05表示差異有顯著性意義。2結(jié)果2.1各組大鼠血糖、體質(zhì)量及uaer檢測(cè)結(jié)果比較實(shí)驗(yàn)期間,正常對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好,無(wú)死亡;糖尿病造模成功后大鼠均出現(xiàn)多飲、多尿、多食、消瘦及生長(zhǎng)行動(dòng)遲緩等癥狀。其中,D組有3只死亡,Ⅰ組有2只死亡,其中D組2只死于灌胃誤傷,余死因不詳。D組及Ⅰ組血糖均明顯高于C組、體質(zhì)量均低于C組;D組與I組間血糖、體質(zhì)量異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。D組及I組UAER均顯著高于C組;I組UAER較D組顯著降低(表1)。2.2各組腎組織病理學(xué)形態(tài)變化與C組相比,D組大鼠腎小球截面積、平均腎小球體積明顯增大,I組平均腎小球體積較D組明顯降低(圖1)。2.3cat及gsh-px活性D組腎組織MDA含量明顯高于C組,SOD、CAT及GSH-PX活性明顯低于C組;I組腎組織MDA含量明顯低于D組,SOD、CAT及GSH-PX活性明顯高于D組(表2)。2.4腎組織icam-1mrna表達(dá)情況D組腎組織NF-κB活性明顯高于C組;I組明顯低于D組(表3)。半定量RT-PCR結(jié)果顯示,在509bp處可見(jiàn)清晰的ICAM-1擴(kuò)增條帶,在217bp處可見(jiàn)內(nèi)參照β-actin的條帶。D組腎組織ICAM-1mRNA表達(dá)明顯高于C組;I組腎組織ICAM-1mRNA表達(dá)明顯低于D組(圖2,表3)。3伊貝沙坦治療大鼠腎組織中抗氧化酶活性的變化腹腔注射STZ制備大鼠糖尿病動(dòng)物模型的方法已被廣泛采用。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外基本認(rèn)定糖尿病大鼠血糖值>16.7mmol/L作為糖尿病大鼠的成模標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)中,用20g/LSTZ按65mg/kg腹腔注射,72h后,出現(xiàn)多飲、多尿、多食等癥狀,測(cè)空腹血糖>16.7mmol/L,病程中血糖始終在建模時(shí)的高水平波動(dòng),未見(jiàn)轉(zhuǎn)復(fù),表明本實(shí)驗(yàn)中DM大鼠模型成立。本研究觀察發(fā)現(xiàn),與正常組大鼠比較,糖尿病組大鼠出現(xiàn)明顯的腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)增多,平均腎小球體積增加,系膜基質(zhì)增生明顯,腎小球系膜區(qū)、基底膜區(qū)明顯深染擴(kuò)大;伴隨尿微量白蛋白升高;伊貝沙坦治療12周后,腎組織形態(tài)學(xué)損害明顯改善,包括腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)明顯減少、平均腎小球體積增加程度減輕,毛細(xì)血管腔開(kāi)放、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯改善、腎小球基底膜增厚及系膜細(xì)胞增生明顯減輕,同時(shí)增加的尿蛋白減少減輕,而血糖并無(wú)明顯改變。表明伊貝沙坦能夠阻止或延緩糖尿病大鼠腎臟的病理?yè)p害。糖尿病時(shí)腎組織中自由基代謝異常,高血糖及其代謝產(chǎn)物本身都是氧化劑,它們都消耗自由基清除劑;與葡萄糖接觸時(shí),抗氧化酶本身的糖基化也會(huì)降低其生物活性,導(dǎo)致體內(nèi)自由基大大增加,同時(shí)機(jī)體抗氧化防御能力下降,腎臟局部氧自由基的產(chǎn)生及清除失衡而使腎組織中ROS增多,ROS可直接引起生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化、細(xì)胞內(nèi)蛋白及酶變性,最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡或凋亡、組織損傷和疾病發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病各組大鼠腎組織中MDA含量高于正常組,SOD、CAT、GSH-PX活性均低于于正常組。經(jīng)過(guò)治療后,伊貝沙坦治療組腎組織中MDA含量低于糖尿病組,但仍高于正常組;伊貝沙坦治療組腎組織中SOD、CAT、GSH-PX活性高于糖尿病組,但仍低于正常組。本研究結(jié)果提示氧化應(yīng)激參與了糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制,而且伊貝沙坦對(duì)腎臟的保護(hù)作用與其抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。糖尿病狀態(tài)下腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)活性增高,尤其是腎組織中AngⅡ含量增加,可促進(jìn)ROS的合成,ROS可通過(guò)激活絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號(hào)傳導(dǎo)通路,使核因子抑制蛋白(IκB)磷酸化而被降解,使IκB與NF-κB分離,激活NF-κB。NF-κB是一種具有多向性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子,參與免疫、炎癥等多種基因調(diào)控。近年來(lái)大量的研究表明,糖尿病患者處于炎癥狀態(tài),血清NF-κB活性升高。NF-κB與DN的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Hofmann等發(fā)現(xiàn):DN患者NF-κB表現(xiàn)出更高的結(jié)合活性,且其活性與蛋白尿程度相關(guān),這說(shuō)明NF-κB活性與DN及其程度密切相關(guān)。細(xì)胞間粘附分子-1(Intercel1ularadhesionmolecule-1,ICAM-1)則是NF-κB調(diào)控的一個(gè)下游靶基因,可通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞與單核/巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞黏附而參與DN的病理生理過(guò)程。Sugimoto等用ICAM-1特異性抗體及間接免疫熒光法分析了鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)DM鼠ICAM-1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)DM鼠腎小球ICAM-1表達(dá)增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠腎組織中NF-κB的活性和ICAM-1mRNA的表達(dá)顯著增強(qiáng),伊貝沙坦干預(yù)組腎組織中NF-κB的活性和