第四章細菌的分型及其檢測技術

第四章細菌的分型及其檢測技術邵麗軍1表型分型技術基因分型技術色譜與質譜技術細菌自動化鑒定技術血清學分型、生物化學分型、噬菌體分型、細菌素分型、耐藥譜分型等質粒圖譜分析、聚合酶鏈式反應技術、核糖體分析、染色體酶切物脈沖場凝膠電泳分型、序列分型、多位點序列分型技術等。細菌分型

氣相色譜法、液相色譜法、毛細管電泳技術、飛行質譜技術等。自動細菌鑒定和藥敏分析系統。2主要內容第一節(jié)細菌噬菌體分型技術第二節(jié)細菌素分型技術第三節(jié)細菌的藥物敏感試驗與分型第四節(jié)分子生物學分型技術第五節(jié)色譜和質譜技術在細菌學檢驗中的應用第六節(jié)細菌的自動化鑒定技術3第一節(jié)細菌噬菌體分型技術一、概述二、細菌噬菌體分型的一般原則三、噬菌體的分離、純化與增殖技術四、細菌的噬菌體分型技術五、噬菌體分型優(yōu)缺點（自學）4噬菌體(bacteriophage;phage)是一類能感染細菌、放線菌、真菌、螺旋體等微生物的病毒，屬于專性細胞內寄生的微生物。自然界分布廣泛，凡有細菌的場所，均可能存在相應的噬菌體。一、概述5噬菌體的基本形態(tài)蝌蚪形微球形（無尾）細桿形（無頭）噬菌體6根據與宿主菌的關系分類毒性噬菌體(virulentphage):溫和噬菌體(temperatephage):78液體培養(yǎng)基中固體培養(yǎng)基上噬菌體在細菌鑒定與分型方面的應用噬菌體與宿主菌共培養(yǎng)澄清噬斑噬菌體的作用具有種特異性，一種噬菌體只能裂解一種或與該種相近的細菌；噬菌斑的形態(tài)、大小和透亮度的不同，可用于鑒定細菌的型別。

9(1)細菌型別與分型噬菌體裂解特異性穩(wěn)定，分型結果重復性好。(2)噬菌體具有較高分型效率，能夠區(qū)分菌株間的細微差別，能滿足流行病學研究的需要。(3)操作方法簡便易行，實驗耗時短，結果記錄簡明。(4)方法應能標準化，以利結果的比較。(5)所用噬菌體應易于獲得較高效價，能較長時間保存，噬斑清晰、大小適中，使之便于觀察和準確記錄。二、細菌噬菌體分型的一般原則10（一）噬菌體分離三、噬菌體的分離、純化與增殖技術制備菌懸液噬菌體富集培養(yǎng)制備裂解液噬菌體確證試驗接種適量樣品，12-24h離心，上清過濾除菌，濾液無菌試驗平板均勻涂布一層菌液，干燥后，表層布5-7點，滴加濾液，一點生理鹽水，培養(yǎng)觀察噬斑11（二）噬菌體純化稀釋裂解液制備噬菌體與敏感菌混合管培養(yǎng)純化10-1至10-55個稀釋度的噬菌體各0.1ml+0.2ml對數菌液，5min選取噬斑較分散的平板，挑取典型噬斑，接種至含菌體培養(yǎng)液中過夜增殖噬菌體。分離純化單斑3次，至平板噬斑形態(tài)大小一致制備底層瓊脂平板制備上層瓊脂平板各稀釋度混合管+3ml半固體培養(yǎng)基，均勻覆蓋平板表層12（三）噬菌體的增殖、保存1、噬菌體增殖2、去除菌體3、噬菌體的保存液體增殖法：定時加入對數期菌體固體增殖法：同時加大菌體和噬菌體的濃度細菌濾器法和三氯甲烷法冷藏保存：無需防腐劑，分裝后7d，不宜超過4w冷凍干燥：2年13（四）噬菌體的效價和裂解譜的測定1、噬菌體效價的測定噬菌體效價：是指1ml液體中所含的活噬菌體的數量。用噬斑形成單位（plaqueformingunit,PFU）表示。單位：PFU/ml;測定方法：雙層瓊脂平板法142、常規(guī)試驗稀釋度測定噬菌體的常規(guī)試驗稀釋度(routinetestdilution,RTD)：是將噬菌體進行10倍系列稀釋，各稀釋度噬菌體溶液點在宿主菌涂布的斑點上，經培養(yǎng)后，能產生僅次于融合性裂解（CL）的最高稀釋度。RTD測定意義：高濃度噬菌體會對宿主菌產生裂解外觀，為避免噬菌體對細菌這種非特異性破壞，使分型噬菌體顯示最高的特異性，將噬菌體間的交叉反應降到最低，建議使用RTD或稱為臨界試驗稀釋。RTD與PFU關系，均是噬菌體效價的計量單位。受噬斑大小的影響，一般的RTD約含1X106

pfu/ml153、裂解譜裂解譜是指一種噬菌體的作用范圍。即確定該噬菌體在種內或屬內的廣譜性，在種外或屬外的交叉反應性。裂解模式是指各種細菌培養(yǎng)物被幾種噬菌體作用而出現的特殊的反應模式，不同的細菌，可呈現不同的反應模式。裂解譜和裂解模式一般用噬菌體原液進行試驗，效價在103～105RTD或109～1011PFU/ml之間。分型試驗一般用1RTD的噬菌體。16制備菌懸液菌液涂布平板選點滴加不同噬菌體不能混有雜菌直接涂布或雙層瓊脂平板斑點滴定的結果記錄如下:融合性溶解程度:融合性溶解(CL)、次融合性溶解(＜CL)、半融合性溶解(SCL)、次半融合性溶解(＜SCL)、融合性不透明溶解，中心混濁，菌苔厚(OL)。單個噬斑:大(L)即＞1.5mm、正常(N)約1.0mm、小(S)0.1~1.0mm、細小(m)＜

0.1mm、微小(μ)。細小和微小均僅能用放大鏡觀察。噬斑的數量:0~5(-)、6~20(±)、1~40(+)、41~60(++)、61~120(+++)、>120(++++)。四、細菌噬菌體分型技術17第二節(jié)細菌素分型技術細菌素(bacteriocin)是某些細菌產生的蛋白質類抗菌物質，這種物質僅對與產生菌親緣關系近的細菌有抗菌作用，而對產生菌本身不敏感。如大腸菌素、綠膿菌素、蠟樣芽胞桿菌素等?？股乜咕厥羌毦⒄婢任⑸镌谏L過程中為了生存競爭需要而產生的化學物質,這種物質可保證其自身生存,同時還可殺滅或抑制其它微生物。細菌產生的有多粘菌素、抗菌肽等。一、概述18細菌素特點抗菌范圍很窄，在治療上應用價值不大，但可進行細菌分型和流行病學調查。細菌素分型方法利用不同型別的細菌素產生菌測定試驗菌的細菌素敏感模式（檢測未知菌）利用已知對不同型別細菌素敏感的菌株作為指示菌，測定試驗菌產生細菌素的模式19（一）待測菌對細菌素敏感模式分型試驗方法（綠膿菌素為例）綠膿菌素制備綠膿菌素敏感試驗細菌素分型試驗有清晰抑菌圈，圈內無菌落者為完全抑菌;抑菌圈中尚有部分菌落為不完全抑菌;無抑菌圈表示該菌對此種綠膿菌素不敏感。二、細菌素分型方法待測菌鋪滿平板，干燥后加細菌素標準品，觀察抑菌圈。20（二）平板交叉劃線分型法適用于細菌素產生量不多的細菌已知細菌素產生菌劃線接種培養(yǎng)基，培養(yǎng)24-48h無菌水沖洗掉菌苔，放置2cm*2cm濾紙片，滴加三氯甲烷，滅菌多種待測菌株與原產細菌素菌株成垂直交叉劃線接種，培養(yǎng)24-48h，觀察交叉點上是否有菌生長，判定待測菌菌型。21（三）待檢菌產生細菌素對指示菌敏感模式分型方法方法同平板交叉劃線分型法已知細菌素產生菌劃線接種培養(yǎng)基，培養(yǎng)24-48h無菌水沖洗掉菌苔，三氯甲烷熏蒸滅菌多種細菌素敏感的指示菌依次垂直交叉劃線接種，培養(yǎng)24-48h，觀察交叉點菌生長情況，判定產生細菌素試驗菌菌型。22一、概述二、紙片擴散法三、稀釋法四、結核分枝桿菌藥敏試驗第三節(jié)細菌的藥物敏感試驗與分型23細菌的藥物敏感試驗(drugsusceptibilitytest)是指在體外測定抗菌藥物抑制或殺死細菌能力的試驗，簡稱藥敏試驗。藥敏試驗方法紙片擴散法、稀釋法、抗生素濃度梯度法（E-試驗法）、聯合藥敏試驗、自動化檢測法、分子生物學方法等。一、概述24（一）基本原理：將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種待檢菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后會不斷地向紙片周圍區(qū)域擴散，形成遞減的濃度梯度，在紙片周圍抑菌濃度范圍內待檢菌的生長被抑制，從而產生透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映檢測菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對待檢菌的最低抑菌濃度（MIC）呈負相關，即抑菌圈愈大，MIC愈小。二、紙片擴散法（K-B法）25(二)培養(yǎng)基和抗菌藥物紙片1．抗菌藥物紙片：商品化，選擇直徑為6.35mm，吸水量為20μl的專用藥敏紙片，用逐片加樣或浸泡方法使每片含藥量達規(guī)定要求。含藥紙片密封貯存于超低溫冰箱。2．培養(yǎng)基：水解酪蛋白（M-H）培養(yǎng)基是兼性厭氧菌和需氧菌藥敏試驗標準培養(yǎng)基，4℃保存。261.在瓊脂平板上挑取形態(tài)相同的菌落4～5個，接種于3～5mLM-H肉湯中，36℃培養(yǎng)4～8h，與標準比濁管比較，可用肉湯或生理鹽水稀釋至與0.5麥氏標準比濁管濁度相同2.在15min內，用無菌棉簽蘸取菌液，并在管壁上擠去多余的菌液后涂布于M-H瓊脂平板上（注意：涂布要均勻、致密），待干3.鑷子滅菌冷卻后，夾取不同藥敏紙片，按一定間隔貼在平板的不同區(qū)域，即兩紙片間距不小于24mm，紙片距平板邊緣不小于15mm。36℃溫箱培養(yǎng)16～18h觀察結果。（三）試驗步驟2728（四）結果判斷和報告

用精確度為1mm的游標卡尺量取抑菌圈直徑。根據標準，作出“敏感”、“耐藥”或“中介”的判斷。幾種抗生素抑菌環(huán)解釋標準及相應的最低抑菌濃度≤4≥8≥1513～14≤1210IU慶大霉素GEN≤0.5≥8≥2314～22≤1315IU紅霉素ERY≤0.1≥2921～28≤2010IU青霉素GP-G敏感耐藥敏感中介耐藥相應的MIC（μg/ml）抑菌環(huán)直徑（mm）紙片含藥量抗生素代號29“敏感”（sensitive，S）：表示測試菌可被測定藥物常規(guī)劑量給藥后在體內達到的血藥濃度所抑制；“耐藥”（resistant，R）：表示測試菌不能被在體內感染部位可能達到的抗菌藥物濃度所抑制，臨床治療無效。“中介”（intermediate，I）：表示測試菌對常規(guī)用藥體液或組織中的藥物濃度的反應率低于敏感株，使用高于正常給藥量有療效。30（五）質量控制采用質控標準菌株和測試菌在同一條件下做藥敏試驗，質控菌株的抑菌圈在允許范圍內，結果可信。目的：檢查試驗條件（如培養(yǎng)基、含藥紙片和接種菌量）、操作技術等是否合格質控標準菌株：大腸桿菌ATCC25922、糞腸球菌ATCC29212、金黃色葡萄球菌ATCC25923等31稀釋法是體外定量測定抗菌藥物抑制細菌生長活性的方法，所獲結果比較準確，常被用作校正其他方法的標準。原理是用一系列不同濃度的藥物與等量細菌作用，找出能抑制細菌生長的最低濃度或殺滅細菌的最低濃度，其結果用最小抑菌濃度(MIC)或最小殺菌濃度(MBC)表示P101。分為肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法。三、稀釋法32肉湯稀釋法123456789101133123456789101134123456789101135特殊性：結核分枝桿菌生長緩慢，在細菌生長之前藥物已擴散而無法影響細菌的生長。方法：絕對濃度法、比例法、放射測量法等。絕對濃度法:是我國實驗室普遍使用方法。將濃度遞減的藥物與等量培養(yǎng)基混合制成含藥培養(yǎng)基，不含藥培養(yǎng)基為對照，分別接種待測菌和標準菌，培養(yǎng)4w，菌落數多于20個為陽性（據此判定MIC）。受試菌與標準菌MIC的菌落數比值≤2判為敏感，≥8為耐藥。比例法：WHO、國際防癆和肺病聯合會推薦的標準方法。將不同稀釋度的待測菌接種于相同濃度的含藥培養(yǎng)基，檢測耐藥性。四、結核分枝桿菌藥敏試驗36一、核糖體分型二、脈沖場凝膠電泳分型三、序列分型四、多位點序列分型技術第四節(jié)分子生物學分型技術37實質：核酸探針雜交分型技術。核糖體RNA（rRNA）基因最為保守，在基因組上存在多個拷貝，以rRNA基因片段為探針，檢出含有rRNA基因的DNA片段，通過分型雜交后的rRNA指紋圖，進行菌種分型和近源菌株的鑒定。原理：樣本DNA經酶切消化，凝膠電泳分離片段，轉印到膜上進行Southern印跡雜交分析。以rRNA基因片段為探針，雜交產生菌株特異性的DNA指紋圖，與平行樣本或數據庫進行比對達到分型目的。一、核糖體分型3839實驗過程探針的設計：一般以16SrRNA和23SrRNA作為探針，現已商品化菌體的分離培養(yǎng)與DNA提取菌體DNA酶切及電泳Southern印跡雜交全自動微生物核糖體基因分型系統。優(yōu)點是高效簡便、快速、以標準化；缺點是費用高。40脈沖場凝膠電泳（PFGE）技術是細菌分型較靈敏的方法，通過檢測染