第三章 凝膠電泳

第三章凝膠電泳電泳方法的分類——根據(jù)支持物1、無支持物2、有支持物：此法可用各種類型的物質(zhì)作支持體，應(yīng)用廣泛。支持介質(zhì)應(yīng)具備以下特性：化學(xué)惰性、不干擾大分子的電泳過程、化學(xué)穩(wěn)定性好、均勻、重復(fù)性好、以及電滲小等。濾紙電泳

(常壓及高壓)、

薄層電泳

(薄膜及薄板)、

凝膠電泳

(瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠)

一類是如紙、醋酸纖維素薄膜、硅膠、礬土、纖維素等。這些介質(zhì)相對來說是化學(xué)惰性的，能將對流減到最小，使用這些支持介質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)分離和在自由溶液中一樣是基于pH環(huán)境中的蛋白質(zhì)的電荷密度。支持介質(zhì)可以分為兩類：另一類是淀粉、瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠。這些凝膠不僅能防止對流，將擴(kuò)散減到最小，而且它們是多孔介質(zhì)，孔徑尺寸和生物大分子具有相似的數(shù)量級，因而具有分子篩效應(yīng)。使用這些凝膠進(jìn)行分離不僅取決于大分子的電荷密度，還取決于分子尺寸。如具有相同電荷密度和不同尺寸的兩種蛋白質(zhì)使用紙電泳不可能分離好；而使用凝膠電泳則可以得到好的分離效果。分子篩效應(yīng)：分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑分離膠時(shí)，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是分子篩效應(yīng)。分子量小，阻力小，移動(dòng)快；分子量大，阻力大，移動(dòng)慢。電荷效應(yīng)：電荷量不同，遷移率不同。醋酸纖維薄膜電泳以醋酸纖維薄膜為支持介質(zhì)。醋酸纖維素是纖維素的醋酸酯，由纖維素的羥基經(jīng)乙酰化而成。它溶于丙酮等有機(jī)溶劑，可涂布成均一細(xì)密的微孔薄膜，即醋酸纖維素膜（celluloseacetatemembrane，簡稱CAM）。3.1醋酸纖維素薄膜電泳醋酸纖維素薄膜電泳示意圖（1）預(yù)處理膜的準(zhǔn)備：根據(jù)分離樣品的多少將醋酸纖維薄膜裁切成合適的大小，在膜片無光澤的一面上用鉛筆輕輕劃一條加樣線。加樣線可選在距膜片一端2～3cm處，有時(shí)也可選在膜片的中央線附近。膜片浸透：在一淺碟或培養(yǎng)皿中倒入所選擇的緩沖液，將膜片小心地浮鋪在緩沖液面上，將膜片的的無光澤面朝下。膜片的底面吸收電極緩沖液后逐漸下沉，直至電極緩沖液將膜片完全浸透。膜片在電極緩沖液完全浸透后，用鈍頭鑷子取出，稍稍用濾紙吸去多余的緩沖液，然后將膜片夾在兩層濾紙之間吸干多余的緩沖液，但不能吸得過干而出現(xiàn)不透明的白色部分。實(shí)驗(yàn)操作步驟用鉛筆在薄膜無光澤面一端2cm處畫一細(xì)線，加樣時(shí)平穩(wěn)地前后或左右來回移動(dòng)加樣器，于細(xì)線處加樣。毛細(xì)管、微量吸管、微量注射器或印模都可以用來加樣。線型加樣醋酸纖維膜上的樣品線條寬度不應(yīng)超過4mm，樣品線與膜片上邊邊緣之間的距離一般為3~5mm。樣品的加樣量或加樣體積隨樣品的濃度、染色和檢測方法等條件的不同而有較大的變化。（2）加樣（3）電泳電泳前，先用鈍頭鑷子將加過樣的膜片安放在電泳槽的支架上，膜片兩端約0.5~1.0cm的部分應(yīng)與支架的頂面緊貼，膜面盡可能不與手指直接接觸，以免膜面受到污染。如果在同一電泳槽內(nèi)同時(shí)安放幾張膜片，應(yīng)避免相鄰膜片之間彼此接觸。在電泳槽的兩個(gè)電極室內(nèi)注入適量的電極緩沖液，用3~4層濾紙作鹽橋。膜片的兩端分別用濾紙鹽橋蓋住，以此將膜片拉平固定并使電流通過。蓋上電泳槽蓋，讓膜片在電泳槽內(nèi)水平靜置平衡10分鐘，然后將電泳槽的兩個(gè)電極與直流電源的正負(fù)極分別相接。架膜加蓋接導(dǎo)線，開機(jī)染色劑要求：不應(yīng)溶解醋酸纖維薄膜

一般蛋白質(zhì)的染色方法氨基黑10B染色：酸性染料，其磺酸基與蛋白質(zhì)反應(yīng)構(gòu)成復(fù)合鹽，是最常用的蛋白質(zhì)染料。麗春紅S方法：是一種水溶性的陰離子重氮染料，帶負(fù)電荷的麗春紅分子與正電荷的蛋白質(zhì)氨基基團(tuán)結(jié)合，也可以非共價(jià)鍵形式與蛋白質(zhì)非極性區(qū)域結(jié)合，顯示紅色蛋白條帶。用3%三氯醋酸配制0.2%麗春紅S溶液，將干燥的膜片浸入此染色劑中。染色時(shí)間不需要嚴(yán)格控制，但一般染色10分鐘比較合適。（4）染色

（5）漂洗/脫色將薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次，至無蛋白區(qū)無色。（6）干燥和透明

干燥：避免膜片發(fā)生卷曲。常用的方法是將膜片夾在兩張濾紙之間，通過濾紙來吸除膜片上多余的液體，然后取出膜片重新夾在兩張濾紙之間，并用合適的平面重物平壓，直至膜片完全干燥平整為止。

為了長期保存和進(jìn)行光吸收掃描測定，需要對膜片進(jìn)行透明化處理。方法是將干燥的膜片浸入透明液中10~20分鐘，然后取出平貼于玻璃板上或夾在兩塊大小合適的玻璃板之間，干后即為透明的薄膜圖譜，可以進(jìn)行掃描測定。

（6）定量測定定量測定的方法有洗脫法和光密度法。洗脫法是將確定的樣品區(qū)帶剪下，用適當(dāng)?shù)南疵搫┫疵摵筮M(jìn)行比色或分光光度測定。光密度法是將染色后的干濾紙用光密度計(jì)直接定量測定各樣品電泳區(qū)帶的物質(zhì)含量。

醋酸纖維薄膜電泳應(yīng)用范圍較廣，可用于檢測和分析血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、體液、脊髓液、脫氫酶、多肽、核酸以及其他生物大分子物質(zhì)。由于醋酸纖維薄膜電泳法快速且簡便，目前在醫(yī)學(xué)和臨床生物化學(xué)等領(lǐng)域已成為一種常規(guī)技術(shù)。應(yīng)用人血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳⒈原理：以醋酸纖維薄膜為支持物，在pH=8.6的巴比妥緩沖液中，人血清蛋白的pI均小于8.6，帶負(fù)電荷，電泳時(shí)向正極移動(dòng)。由于遷移率不同而被分離。蛋白質(zhì)名稱等電點(diǎn)遷移率分子量清蛋白4.885.9×10-569000α1-球蛋白5.065.1×10-5200000α2-球蛋白5.064.1×10-5300000β-球蛋白5.122.8×10-59000～150000γ-球蛋白6.85～7.501.0×10-5156000～300000人血清蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和遷移率優(yōu)點(diǎn)：精確性高?？焖偈r(shí)。一般電泳45-60min即可。靈敏度高，樣品用量少。應(yīng)用面廣。如胎兒甲種球蛋白，溶菌酶，胰島素，組蛋白等用醋酸纖維薄膜電泳能較好地分離。有利于掃描定量及長期保存。缺點(diǎn)：分離效果不太好。優(yōu)缺點(diǎn)

3.2

聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠是由丙稀酰胺（acrylamide，簡稱Acr）和亞甲基雙丙稀酰胺(N，N’-methylenebisacrylamide，簡稱Bis)聚合而成的，具有一定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在形成凝膠的化學(xué)聚合過程中，可以人為控制聚合成具有一定大小孔徑的凝膠。在電泳過程中，凈電荷相近的物質(zhì)在通過凝膠孔洞時(shí)，所受到的阻力和樣品分子的大小和形狀密切相關(guān)，即分子篩作用。原理電泳不僅能分離含有各種大分子物質(zhì)的混合物，而且可以研究生物大分子的特性。諸如如電荷、分子量、等電點(diǎn)以至于構(gòu)象。在恒定的、非解離的緩沖系統(tǒng)中來分離蛋白質(zhì)，屬于非解離電泳。在電泳過程中仍然保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象、亞基之間的相互作用及其生物活性，因而根據(jù)其電泳遷移率，可得到天然蛋白質(zhì)的分子量。3.2

聚丙烯酰胺凝膠電泳——原理聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)——聚合反應(yīng)⑴單體：丙烯酰胺(Acr)；⑵交聯(lián)劑：亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)；⑶催化劑：過硫酸胺或核黃素；⑷加速劑：四甲基乙二胺(TEMED)；⑸產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠。單體-丙烯酰胺結(jié)構(gòu)式交聯(lián)劑-亞甲雙丙烯酰胺聚合反應(yīng)催化劑：過硫酸胺或核黃素催化劑—氧化還原系統(tǒng)作用，使Acr單體帶有游離基，從而與Bis進(jìn)行聚合（一）化學(xué)聚合：AP-TEMED系統(tǒng)過硫酸胺（AP）作為催化劑，四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。AP在水溶液中能產(chǎn)生游離基SO42-(S2O82-→2SO42-)，使丙烯酰胺單體的雙鍵打開，活化形成自由基丙烯酰胺，然后游離Acr和Bis作用就能聚合形成凝膠。TEMED的游離堿基能促進(jìn)AP形成SO42-

。注意：

TEMED量多少都會(huì)影響催化作用，須在堿性條件下聚合分子氧存在，聚合不完全，須去除分子氧，隔絕氧升高溫度能提高聚合，降低溫度能延遲聚合

（二）光聚合：核黃素-TEMED系統(tǒng)

核黃素（riboflavin）在光照下（可見光或紫外光）分解，其黃素部分被還原成無色型，但在有氧條件下無色型又被氧化成帶有游離基的黃素，其也能使Acr和Bis聚合形成凝膠。注意：分離膠的合成一般采用化學(xué)聚合。因?yàn)槿粲霉饩酆希z的孔徑受光照強(qiáng)度與時(shí)間的影響，導(dǎo)致孔徑大小不同，從而影響蛋白質(zhì)的分離。1、試劑質(zhì)量2、溫度和氧氣的影響3、凝膠濃度及丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的比例。凝膠的機(jī)械性能、彈性是否適中是很重要的，膠太軟易于斷裂，尤其在制作板型電泳的薄片狀凝膠時(shí)，太軟很難操作。太硬則脆，也易折斷。凝膠的透明度、粘著度是否合適也影響分離效果。凝膠的機(jī)械性能、彈性、透明度和粘著度取決于凝膠總濃度和Acr與Bis兩者之比例。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的比例可決定凝膠網(wǎng)孔的大小，交聯(lián)劑所占比重越大，凝膠的網(wǎng)孔就越小。影響凝膠聚合的因素PAG的濃度與孔徑的關(guān)系

凝膠總濃度T—100ml凝膠溶液中含有Acr和Bis的總克數(shù)。T=（a+b）/m×100%（a為丙烯酰胺的量(g)，b為甲叉雙丙烯酰胺的量(g)，m為緩沖液的體積(ml)）T越大，凝膠孔徑越小，適用于分離分子量較小的物質(zhì)。T越小，凝膠孔徑越大，適用于分離分子量較大的物質(zhì)。C—Bis占單體與交聯(lián)劑總量的百分比。C=b/（a+b）×100%如果a/b<10，制成的凝膠脆而易碎，堅(jiān)硬而不透明。如果a/b>100，T為5%的凝膠呈糊狀，容易破碎。

a/b在30左右，凝膠富有彈性，且完全透明。電泳類型按具體操作分垂直板形電泳圓盤電泳按凝膠系統(tǒng)的均勻性分連續(xù)PAGE

不連續(xù)PAGE8.38.38.86.7不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)不連續(xù)性表現(xiàn)在以下方面：1、凝膠層的不連續(xù)性：兩層凝膠T與C不同，孔徑不同。上層為大孔徑的濃縮膠，蛋白質(zhì)在大孔徑濃縮膠中移動(dòng)，受阻力小，移動(dòng)速度快。下層為小孔徑的分離膠。2、緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同：電極緩沖液為pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.7的Tris-HCl緩沖液，而分離膠為pH8.8的Tris-HCl緩沖液。分離原理甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3帶負(fù)電，朝正極移動(dòng)，進(jìn)入濃縮膠（pH6.7），甘氨酸解離度很小，有效遷移率很低，移動(dòng)速度較慢，稱為慢離子。HCl

是強(qiáng)電解質(zhì)，

=1，Cl-有效遷移率大，移動(dòng)速度快，稱快離子。蛋白質(zhì)有效遷移率介于兩者之間。電泳開始時(shí)氯離子泳動(dòng)率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場強(qiáng)度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場強(qiáng)度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動(dòng)，形成穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動(dòng)界面附近，濃縮成一中間層在這樣一個(gè)不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即樣品的濃縮效應(yīng)，凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，由于這三種物理效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液

甘氨酸HCl蛋白質(zhì)濃縮膠分離膠樣品低電導(dǎo)區(qū)

PAGE的特點(diǎn)1.具有分子篩效應(yīng)，分辨率高2.樣品不易擴(kuò)散，用量少，靈敏度可達(dá)10-6g3.化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，分子結(jié)構(gòu)中富含酰胺基具有穩(wěn)定的親水基團(tuán)4.凝膠不帶電荷，消除了電滲現(xiàn)象5.機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，在一定濃度范圍內(nèi)無色透明6.網(wǎng)孔可調(diào)節(jié)。聚丙烯酰胺膠體的制備制膠模1梳形樣品槽模板2長玻璃板（后面）3短玻璃板（前面）4U形橡膠框聚丙烯酰胺凝膠膠體的制備示范PAGE

垂直板式電泳PAGE應(yīng)用范圍較廣，可用于脫輔基蛋白的分離、cDNA合成產(chǎn)物的分離、DNA片斷的分離制備、DNA順序分析、生物大分子分子量的測定、及RNA序列分析等。應(yīng)用例1：玉米改良單交種的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。不同玉米種子清蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果。條件：分離膠T=13.8%，濃縮膠T=4.9%，清蛋白樣品16加樣，電壓300～350V10～15min后將電壓逐漸升至500V并穩(wěn)壓電泳40～45min，考馬斯亮蘭R250染色5min。十二烷基磺酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS），簡稱SDS電泳，主要用于測定蛋白質(zhì)分子量研究。如果在PAGE系統(tǒng)中加入一定量的SDS，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量大小，而其他因素對電泳遷移率的影響幾乎可以忽略不計(jì)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15,000～20,000之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對數(shù)呈直線關(guān)系，符合下列方程式：（3.3）式中，MW為蛋白質(zhì)的分子量，mR為相對遷移率，b為斜率，K為截距，在條件一定時(shí)，b和K均為常數(shù)。采用SDS系統(tǒng)作單向電泳，不僅可以根據(jù)分子量大小對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，而且可以根據(jù)電泳遷移率大小測定蛋白質(zhì)的分子量。3.3十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳在聚丙烯酰胺凝膠中加入陰離子表面活性劑十二烷基磺酸鈉（SDS），不影響凝膠的形成，不影響蛋白質(zhì)的電泳遷移率，蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要取決于其自身分子量的大小。SDS能打開蛋白質(zhì)分子間的氫鍵和疏水鍵，使蛋白質(zhì)變性成為松散的線狀(緩沖液中加入巰基乙醇)。同時(shí)大多數(shù)蛋白質(zhì)的每個(gè)氨基酸能與固定量的SDS相結(jié)合，形成SDS–蛋白質(zhì)復(fù)合物。蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合后，所帶上的SDS負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而也就掩蓋或消除了不同種類蛋白質(zhì)分子之間原有的電荷差異。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳具有設(shè)備簡單，樣品用量甚微，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為測定大多數(shù)蛋白質(zhì)分子量的常用方法。3.4瓊脂糖凝膠天然瓊脂（agar）：又名瓊膠、菜燕、凍粉。從石花菜及其它紅藻類植物提取出來的一種線狀高聚物。瓊脂糖是瓊脂膠中脫去硫酸酯基和丙酮酸酯基后不帶電荷的中性組成成分。由半乳糖及其衍生物構(gòu)成。瓊脂糖鏈依分子內(nèi)和分子間氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠。瓊脂糖凝膠的特點(diǎn)（一）優(yōu)點(diǎn)1.因不含硫酸根和羧基，幾乎消除了瓊脂的電滲2.對蛋白質(zhì)吸附極微，故無拖尾現(xiàn)象。3.凝膠結(jié)構(gòu)均勻，孔徑較大，可用來分離酶的復(fù)合物、核酸、病毒等大分子物質(zhì)。4.透明度較好，可直接或干燥成薄膜后進(jìn)行染色。5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量測定。6.瓊脂糖無毒，操作簡單。（二）缺點(diǎn)1.機(jī)械強(qiáng)度差，易破碎，濃度不能太低。2.易被細(xì)菌污染，不易保存，臨用前配制。3.瓊脂糖支持層上的區(qū)帶易于擴(kuò)散，電泳后必須立即固定染色。4.與PAGE相比，分子篩作用小。分離作用瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要依賴于核酸的分子量及分子構(gòu)型。DNA分子通過瓊脂糖凝膠的速率與其分子量的常用對數(shù)成反比。通常膠的濃度越低，適于分離的DNA越大，這是一個(gè)總的規(guī)律。在分子量相當(dāng)?shù)那闆r下，DNA的電泳速度次序如下：共價(jià)閉環(huán)cccDNA>直線DNA>開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。實(shí)驗(yàn)操作預(yù)染色的標(biāo)本應(yīng)用1.

適用于大分子的核酸、核蛋白等的分離、鑒定及純化2.臨床生化檢驗(yàn)中常用于乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)及其同工酶的分離與檢測3.為不同類型的高脂蛋白血癥、冠心病等提供生化指標(biāo)瓊脂糖凝膠電泳分離血清脂蛋白原理血清脂蛋白經(jīng)飽和蘇丹黑B預(yù)染后，以瓊脂糖凝膠為支持介質(zhì)，在pH8.6巴比妥緩沖液中電泳，根據(jù)各脂蛋白的組成、大小、形狀分離成不同區(qū)帶。(一)血清脂蛋白(lipoprotein)的組成

ApoAApoB蛋白質(zhì)：即載脂蛋白

ApoCApoDApoE

甘油三酯（TG）脂類磷脂（PL）

游離膽固醇（FC）

膽固醇酯（CE）各種血漿脂蛋白的組成沒有質(zhì)的差別，但其組成比例及含量大不相同。CM含甘油三酯最多，其次是VLDL；LDL含膽固醇及膽固醇酯最多；HDL含蛋白質(zhì)最多。應(yīng)用——瓊脂糖凝膠電泳分離血清脂蛋白（二）血漿脂蛋白的分類1.超速離心法：根據(jù)密度不同而分開乳糜微粒(chylomicron,CM)(<0.96)低極低密度脂蛋白(0.96~1.006)(verylowdensitylipoprotein,VLDL)中間密度脂蛋白(1.006~1.019)(intermediatedensitylipoprotein,IDL)低密度脂蛋白LDL(1.019~1.063)(lowdensitylipoprotein,LDL)高密度脂蛋白HDL(1.063~1.21)(highdensitylipoprotein,HDL)高血中游離脂酸與清蛋白結(jié)合運(yùn)輸，不列入血漿脂蛋白之內(nèi)。應(yīng)用——瓊脂糖凝膠電泳分離血清脂蛋白2、電泳法：根據(jù)電泳遷移率不同而分開。

-脂蛋白（-LP）快 前-脂蛋白（pre-LP)

-脂蛋白（-LP)

乳糜微粒（CM）慢以血清球蛋白遷移率作為參照，pH8.6>pI，各種脂蛋白均帶負(fù)電，電泳時(shí)由負(fù)極到正極；VLDL為圓形，受阻力小，LDL形態(tài)不規(guī)則，受阻力大，所以VLDL跑在前。HDL與α球蛋白遷移在同一位置故稱α-脂蛋白；LDL與β球蛋白遷移在同一位置，稱為β-脂蛋白；VLDL區(qū)帶遷移在β脂蛋白之前故稱前β-脂蛋白；乳糜微粒留在原點(diǎn)樣處不動(dòng)。（一）血漿脂蛋白的分類（三）結(jié)構(gòu)特征CMVLDLLDLHDL甘油三脂膽固醇蛋白質(zhì)帶電量（Q）顆粒大?。╩m）密度電泳速度形態(tài)多多少少大小慢規(guī)則不規(guī)則少少多多小大快正常參考值（百分比）α-脂蛋白30-40%前β-脂蛋白15%β-脂蛋白55%注意事項(xiàng)：①血清樣品要新鮮；②為了免去離心步驟，吸取預(yù)染血清時(shí)，應(yīng)吸取上層，下層或管底可能有染料顆粒沉淀，否則應(yīng)再離心后吸預(yù)染血清。3.5等電聚焦電泳等電聚焦(isoelectricfocusing，IEF)定義IEFE一種利用具有pH梯度的支持介質(zhì)分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。60年代建立，40多年來發(fā)展很快，成為當(dāng)前電泳中最高分辨率的技術(shù)?；驹砝玫鞍踪|(zhì)分子或其他兩性分子的等電點(diǎn)的不同，在一個(gè)穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的pH梯度中進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離和分析。分析對象限于蛋白質(zhì)和兩性分子分析條件凝膠中有穩(wěn)定的、連續(xù)的和線性的pH梯度3.5.1原理蛋白質(zhì)是一類兩性電解質(zhì)，構(gòu)成蛋白質(zhì)的一些氨基酸側(cè)鏈在一定pH的溶液中是可解離的，由于不同蛋白質(zhì)有著不同的氨基酸組成，所以蛋白質(zhì)pI只取決于其氨基酸組成，是一個(gè)理化常數(shù)。各種蛋白質(zhì)都有自己特定的pI。我們可以利用蛋白質(zhì)的這個(gè)理化性質(zhì)對其進(jìn)行分離。

NH3+NH3+NH2PPPCOOHCOO-COO-

pH＜pIpH＝pIpH＞pI在電泳介質(zhì)中放入載體兩性電解質(zhì)，當(dāng)通入直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)形成一個(gè)由正極到負(fù)極逐漸增加的pH梯度，正極附近是低pH區(qū)，負(fù)極附近是高pH區(qū)。給蛋白質(zhì)樣品施加電場，則在堿性區(qū)域的蛋白質(zhì)分子，因?yàn)閹в胸?fù)電荷，就向陽極移動(dòng)，直到某一pH時(shí)凈電荷為零時(shí)停止移動(dòng)，此時(shí)即達(dá)到等電位狀態(tài)，此種蛋白質(zhì)分子在此pH環(huán)境下聚集。同樣，處在酸性區(qū)域的蛋白質(zhì)分子，因?yàn)閹в姓姾啥蜿帢O移動(dòng)，直到在它們pI處聚集為止。進(jìn)行IEFE必須具備3個(gè)條件：有一個(gè)在電泳條件下基本穩(wěn)定、重復(fù)性良好的pH梯度有一個(gè)抗對流的電泳材料，使已經(jīng)分離的樣品不再重新混合電泳后有適當(dāng)?shù)姆椒▉龛b定分離的區(qū)帶3.5.2載體兩性電解質(zhì)一、理想的載體兩性電解質(zhì)（Carrierampholytes）應(yīng)具備的特征：①分子量要小，以便于后續(xù)用透析或凝膠過濾法除去被分離大分子物質(zhì)；②化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；③各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的緩沖能力；④在pI處具有足夠的電導(dǎo)，導(dǎo)電性均勻；⑤兩性電解質(zhì)載體的數(shù)目要足夠多；⑥可溶性好；⑦對280nm的紫外光沒有或僅有很低的吸光度，不干擾樣品的測定。1961年，Svensson提出了自載體兩性電解質(zhì)的概念。緩沖液物質(zhì)應(yīng)該具有兩個(gè)基本的特性：1）應(yīng)該是兩性的，以使它們在分離柱中也能達(dá)到一個(gè)平衡的位置；2）應(yīng)該可作為“載體”。二、載體兩性電解質(zhì)合成七年后，由Vesterberg合成了載體兩性電解質(zhì)。由許多脂肪族的多氨基多羧酸的異構(gòu)體和同系物組成，具有連續(xù)改變的氨基與羧基比。本質(zhì)：一系列脂肪族多氨基多羧酸同系物和異構(gòu)體，具有很多既不相同又十分接近相互連接的pI值。合成：通過調(diào)節(jié)胺和酸的比例，可以得到氨基與羧基不同比例的脂肪族多氨基多羧酸。pH范圍：pH3-10多乙烯多胺+丙烯酸Ampholine加成反應(yīng)二、載體兩性電解質(zhì)合成三、pH梯度的形成載體兩性電解質(zhì)是一系列不同分子的兩性電解質(zhì)的混合物,在通電后，它們各自遷移到適當(dāng)位置形成一個(gè)連續(xù)的pH梯度。pH梯度形成的過程

（一）沒通電時(shí)的變化

將兩性電解質(zhì)載體溶液引入電泳管，并在電泳儀的正極槽注入稀酸，負(fù)極槽中注入稀堿。電泳管中各段pH相同，為兩性電解質(zhì)載體混合物的平均pH（pHo）正極酸液的pH很低（pHa）負(fù)極堿液的pH很高（pHb）電解槽中，通電后，正負(fù)兩極都會(huì)發(fā)生電極反應(yīng)：正極端反應(yīng)：6H2O→O2+4H3O++4e-負(fù)極端反應(yīng)：4H2O+4e-→2H2+4OH-

在負(fù)極引起pH值的升高，在正極pH下降，另外在電極槽的正極端放的是酸性溶液，負(fù)極端放的是堿性溶液造成了在電極附近pH的急劇變化。由于載體兩性電解質(zhì)是一系列不同分子的兩性電解質(zhì)的混合物所組成的，設(shè)其中某一成分為A，它的pI=pH’，當(dāng)環(huán)境中的pH>pH’時(shí)，它帶負(fù)電荷，朝正極移動(dòng)。（二）引入電場時(shí)的變化pH+-pH+-pH=pH’A-當(dāng)環(huán)境pH<pH’時(shí)，它帶正電荷，朝負(fù)極移動(dòng)，直至移動(dòng)到它的等電點(diǎn)處，在那里聚集。由于兩性電解質(zhì)A在它的pI處具有一定的緩沖能力，因此在它附近形成一個(gè)pH穩(wěn)定區(qū)域。（圖c）pH+-cpH=pH’同樣載體兩性電解質(zhì)中各種兩性電解質(zhì)也會(huì)各自遷移到它們的等電點(diǎn)處，由于它們的數(shù)量足夠多，各自的等電點(diǎn)相差很小，從而形成一個(gè)pH梯度。（圖d）假設(shè)在一個(gè)系統(tǒng)中含有極多的有適當(dāng)?shù)牡入婞c(diǎn)和它的等電點(diǎn)處有一定的緩沖能力的兩性電解質(zhì)，因此形成的pH梯度將是連續(xù)平滑的。pH+-d載體兩性電解質(zhì)分子中帶有最低等電點(diǎn)的分子（荷最多的負(fù)電）將最快地向陽極遷移。當(dāng)它達(dá)到凈電荷是零的位置時(shí)才停止。其次一些低pI的載體兩性電解質(zhì)分子（荷其次多的負(fù)電）也將向陽極移動(dòng)，直到它的凈電荷被減少到零才停止。低pH高pH（三）電泳結(jié)束后的變化

所有的載體兩性電解質(zhì)分子以增加pI級數(shù)的辦法將分別在陽、陰極之間到達(dá)它們自己的位置而給出一個(gè)pI梯度。低pH高pH3.5.3方法（1）制膠

（2）溶液配制（3）灌膠和取膠（4）等電聚焦（5）pH梯度測定（6）固定、染色、脫色（7）保存3.5.4條件選擇（1）穩(wěn)定介質(zhì)的選擇

作用：抗對流，防止擴(kuò)散1.液體介質(zhì)：蔗糖、Ficoll2.凝膠介質(zhì)：瓊脂糖，葡聚糖、聚內(nèi)烯酰胺凝胺（2）載體兩性電解質(zhì)和pH梯度范圍的選擇質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：導(dǎo)電性好，緩沖能力大，可增加施加在凝膠上的電壓，從而縮短電泳時(shí)間，提高分辨率。

pH梯度的線性：依賴于載體兩性電解質(zhì)的質(zhì)量。凝膠的pH梯度范圍是由所加的載體兩性電解質(zhì)的pH范圍決定的。

pH梯度范圍的選擇：決定于被分析的的蛋白質(zhì)pI。對于一個(gè)未知樣品，通常先用寬的pH范圍來找出欲測蛋白質(zhì)的pI位置，然后再用合適的窄pH范圍以更好地分辨這些譜帶并精確地測定pI。電極溶液的作用：避免樣品或載體兩性電解質(zhì)在陽極氧化或在陰極還原。電極液通常由不揮發(fā)的酸或堿配制。強(qiáng)酸或強(qiáng)堿液被作為寬pH范圍的電極液，窄pH范圍則用弱酸或弱堿。

（3）電極溶液選擇六種不同水稻品種的種子蛋白等電聚焦結(jié)果3.5.4應(yīng)用1.分析分離制備蛋白質(zhì)、多肽①區(qū)分人血清蛋白②測出異常免疫球蛋白③基因分型④csf中寡克隆區(qū)帶的檢測2.測定pI可鑒定蛋白質(zhì)、多肽3.雙相電泳中，IEFE作為第一相IEF的優(yōu)缺點(diǎn)？3.6雙向電泳雙向電泳是一種由任意兩個(gè)單向凝膠電泳組成的，在第一向電泳后再在與第一向垂直的方向上進(jìn)行第二向電泳的分離方法。雙向電泳分離的設(shè)計(jì)應(yīng)使蛋白質(zhì)在各向上依據(jù)不同的原理進(jìn)行分離。1975年，O’Farrell等人根據(jù)不同組分之間的等電點(diǎn)及分子量差異這兩種不同的分離原理，建立了IEF/SDS。目前雙向電泳大都是這種IEF/SDS，這種雙向電泳的第一向?yàn)榈入娋劢?，第二向?yàn)镾DS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。樣品經(jīng)過電荷和質(zhì)量兩次分離后，可以得到分子的等電點(diǎn)、分子量等信息。雙向電泳的基本原理一般與組成它的兩個(gè)單向電泳的基本原理相同，即分別為等電聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理。雙向電泳（2DE）示意圖提取的總蛋白溶液等電聚焦，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)按等電點(diǎn)進(jìn)行分離SDS分離，使得蛋白質(zhì)按分子量大小排序分子量大小通過雙向電泳使得不同等電點(diǎn)和分子量的蛋白質(zhì)根據(jù)其自身特性分布到凝膠的不同位置從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的雙向分離硝酸銀染色圖譜考馬斯亮藍(lán)染色圖譜2-DE圖譜雙向凝膠電泳技術(shù)流程樣品制備第一向等電聚焦第二向SDS蛋白檢測圖像分析問題及解決辦法樣品制備雙向電泳的最關(guān)鍵步驟之一制備原則：應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。等電聚焦通過10000V高壓使得蛋白質(zhì)按照其等電點(diǎn)特性進(jìn)行聚焦步驟：膠條水化、低壓除鹽、高壓聚焦、低壓維持聚焦時(shí)間：聚焦時(shí)間太短，會(huì)導(dǎo)致水平和垂直條紋，過長會(huì)造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白丟失。最佳時(shí)間的確定需要根據(jù)蛋白樣品類型、蛋白載樣量、PH范圍和膠條長度來確定。膠條平衡等電聚焦結(jié)束后進(jìn)行SDS電泳之前需進(jìn)行膠條平衡，以便于被分離的蛋白質(zhì)與SDS充分結(jié)合，保證SDS電泳的順利進(jìn)行步驟：一般采用兩步平衡法，用含SDS、DTT、尿素和甘油等的緩沖液先平衡一次，再用碘乙酰胺取代DTT后再平衡一次SDS電泳使得蛋白質(zhì)按照分子量的大小不同而分離，與普通SDS相似在雙向電泳系統(tǒng)中無需濃縮膠，因?yàn)榈谝幌虻入娋劢挂呀?jīng)使得蛋白得到濃縮蛋白檢測理想顯色劑的7S安全（safety）靈敏（sensitivity）簡單（simplicity）特異性（specificity）快速（speed）穩(wěn)定（stability）兼容性（synergy）蛋白檢測硝酸銀染色

優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，缺點(diǎn)：重復(fù)性差，質(zhì)譜兼容性低考馬斯亮蘭染色：

優(yōu)點(diǎn)：重復(fù)性好，質(zhì)譜兼容性高缺點(diǎn)：靈敏度低熒光染色：優(yōu)點(diǎn)：重復(fù)性好，質(zhì)譜兼容性高、靈敏度高缺點(diǎn)：價(jià)格貴其它染色方法：

胺基黑染色、印度墨水染色、金屬鹽負(fù)染等凝膠的圖像處理和分析典型流程：凝膠圖像的掃描；圖像加工；斑點(diǎn)檢測和定量；凝膠配比；數(shù)據(jù)分析；數(shù)據(jù)呈遞和解釋；2-DE數(shù)據(jù)庫的建立常用軟件：Image-Master(GEHealthcare)PDquest(Bio-Rad)分辨率：雙向電泳的分辨率較高。一般的2-DE也能分辨1000-3