超嗜熱古球菌亞基基因的克隆與原核表達(dá)

超嗜熱古球菌亞基基因的克隆與原核表達(dá)

0cp對(duì)外克氏原核的分子身份證首先，發(fā)現(xiàn)了熱休克蛋白（hbs）。這種類型的蛋白質(zhì)通常在高溫等條件下由細(xì)胞過(guò)度轉(zhuǎn)化引起。在近年來(lái)的研究中，發(fā)現(xiàn)hbs的合成是細(xì)胞中不可或缺的一部分，是細(xì)胞生存的必要因素。它參與了細(xì)胞新細(xì)胞分子的正確折疊，這與蛋白質(zhì)的變形和復(fù)合性密切相關(guān)。mck存在于超嗜熱菌的螺旋體1（hyperermom-phorc細(xì)胞kod1，hpk）中。這類基因發(fā)現(xiàn)于聚合酶鏈反應(yīng)（pcr）中，這為進(jìn)一步探討cpk的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。1材料和方法1.1czczHPK基因組DNA由日本大阪大學(xué)工學(xué)部今中教授惠贈(zèng).載體:pBluescriptSK(+),2.96kb,氨芐青霉素抗性,半乳糖苷酶基因(lacZ)插入失活,含有一多克隆位點(diǎn);pBV220,3.66kb,氨芐青霉素抗性,在串聯(lián)的λ噬菌體啟動(dòng)子PLPR下游有一多克隆位點(diǎn).均為本中心保存.細(xì)菌菌株:E.coliJM109,基因型recAlSupE44endA1hsdR17gyrA96relA1thi△(lac-proAB)F′[traD36proAB+lacIqlacZ△M15],本中心保存.PCR引物由上海生物工程公司合成.373A自動(dòng)測(cè)序儀為美國(guó)PE公司產(chǎn)品.1.2方法1.2.1內(nèi)切酶初篩pamhi擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)為:引物A:5′ACGGAATTCATGGCCCAGCTCGCAGGCCA3′,引物B:5′AGCGGATCCTCAGTCAAGGTCGCTTCCG3′.在引物A5′端添加了內(nèi)切酶EcoRI識(shí)別序列,在引物B3′終止碼TGA之后添加了BamHI識(shí)別序列.以HPK基因組DNA為模板,在PTC-100PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)30個(gè)循環(huán),然后取5μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定.1.2.2熒光標(biāo)記法測(cè)序檢測(cè)質(zhì)粒dna按常規(guī)方法將PCR擴(kuò)增片段克隆至pBluescript質(zhì)粒EcoRI-BamHI位點(diǎn),轉(zhuǎn)化E.coliJM109,挑取單個(gè)藍(lán)色菌落,37℃培養(yǎng)后堿裂解法提取質(zhì)粒DNA,將鑒定有正確插段的克隆作為測(cè)序模板,熒光標(biāo)記測(cè)序引物,373A自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)定其核苷酸序列,計(jì)算機(jī)分析所得序列,其克隆命名為pBSCpk.1.2.3s1493-2000v2005原核表達(dá)載體的構(gòu)建EcoRI+BamHI酶切pBSCpk質(zhì)粒并回收cpkB基因片段,重組至pBV220原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化JM109,命名為pBVCpk.挑取單個(gè)菌落于LB培養(yǎng)基,32℃培養(yǎng)至A600nm0.3～A600nm0.5,42℃繼續(xù)培養(yǎng)3h～5h,誘導(dǎo)cpkB基因表達(dá),每2h取樣一次,進(jìn)行SDS電泳檢測(cè).1.2.4洗脫溶劑的制備將JM109(pBVCpk)菌種擴(kuò)大培養(yǎng),誘導(dǎo)表達(dá)4h后離心收菌,稱取菌體濕重,每10g菌體懸浮于100mLSTE(250g/L庶糖,10mmol/LTris.ClpH8.5,1mmol/LEDTApH8.0)中,加溶菌酶適量,脫氧膽酸至40g/L,MgCl2,DNaseI適量,攪拌至粘度減低后離心棄沉淀,上清在90℃水浴中保溫20min,離心,取上清對(duì)20mmol/LTris.Cl,1mmol/LEDTApH8.0透析16h～24h,換液3次～4次,然后上DEAESepharoseFF陰離子交換柱層析,洗脫液A:50mmol/LPB,pH6.2,洗脫液B:洗脫液A+1mol/LNaCl,梯度洗脫,收集洗脫峰.2結(jié)果2.1cpk基因片段聚合酶鏈反應(yīng)經(jīng)30個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)后,10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,見(jiàn)cpkB基因片段長(zhǎng)1.6kb,與預(yù)期長(zhǎng)度相符(Fig1).2.2核苷酸和氨基酸序列隨機(jī)挑選7個(gè)克隆,提取質(zhì)粒DNA后,用PCR方法篩選,結(jié)果其中6個(gè)含有1.6kb擴(kuò)增片段,選3號(hào)和4號(hào)克隆進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定,兩者測(cè)定結(jié)果均與報(bào)道序列相同.其推導(dǎo)氨基酸序列的計(jì)算機(jī)分析顯示,CpkB的氨基酸序列與分子伴侶蛋白TF55和TCP-1具有較高的同源性,分別為55%和41%,結(jié)果見(jiàn)Fig2,3.2.3sds-東南角電泳檢測(cè)接種重組陽(yáng)性的JM109(pBVCpk)菌種,42℃誘導(dǎo)培養(yǎng),每隔2h取樣1次,120g/LSDS電泳檢測(cè),結(jié)果在分子質(zhì)量近60ku處表達(dá)一新生蛋白,與cpkB基因推導(dǎo)氨基酸序列的理論分子質(zhì)量一致,在實(shí)驗(yàn)期間,表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加(Fig4).2.4sds-東南角電泳CpkB蛋白經(jīng)溶菌酶裂菌、高熱處理加上陰離子交換柱層析后,在SDS電泳上顯示1條帶,分子質(zhì)量約60ku(Fig5).3cpk蛋白的純化HPK是在日本KagoshimaKodakara島一硫氣溫泉中分離到的一株耐熱菌,其最佳生長(zhǎng)溫度為95℃.從該細(xì)菌中分離到的許多蛋白質(zhì)都具有耐高溫的特性.在今中教授的直接支持下,我們分離克隆了其熱休克蛋白基因β亞基cpkB,重組至帶PL啟動(dòng)子的原核表達(dá)載體pBV220,進(jìn)而升溫誘導(dǎo)使其成功的表達(dá),實(shí)現(xiàn)了獲取CpkB蛋白更為經(jīng)濟(jì)的途徑.CpkB蛋白在E.coli中的表達(dá)不形成包函體,表達(dá)菌經(jīng)溶菌酶裂菌、離心后絕大部分存在于上清之中.因?yàn)镃pkB蛋白具有耐高溫特性,我們利用該特點(diǎn)純化CpkB,即以90℃高熱處理使絕大部分的大腸桿菌蛋白變性而發(fā)生沉淀,故而使CpkB蛋白的純化效率極大地提高.該研究結(jié)果為進(jìn)一步探討CpkB蛋白的結(jié)構(gòu)與功能奠定了基礎(chǔ).cpkB基因推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分析顯示,該蛋白與另一嗜熱菌來(lái)源的熱休克蛋白TF55及哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)普遍存在的TCP-1蛋白(t-complexpolypeptide-1)具有很高的同源