嚴(yán)重急性呼吸綜合征患者尸解肺標(biāo)本病理改變和致病機(jī)制的研究

嚴(yán)重急性呼吸綜合征患者尸解肺標(biāo)本病理改變和致病機(jī)制的研究

嚴(yán)重的急性呼吸綜合征（ss）是一種嚴(yán)重的人類疾病之一。Peiris等采用病毒培養(yǎng)、血清免疫學(xué)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法研究發(fā)現(xiàn)SARS患者的鼻咽分泌物和血清標(biāo)本,存在一種新型的冠狀病毒,故于2003年4月8日提出這種新型的冠狀病毒可能是SARS的病因,并根據(jù)Koch原則和猴接種實(shí)驗(yàn),于4月16日得到WHO的正式確認(rèn),命名為SARS相關(guān)冠狀病毒(SARS-CoV)。然而,SARS-CoV的致病機(jī)制仍不清楚。為了進(jìn)一步了解SARS的病理改變和致病機(jī)制,我們對(duì)6例SARS患者的尸解肺標(biāo)本進(jìn)行了深入的研究。中心病例治療病例的選擇標(biāo)準(zhǔn):6例尸解病例(2003年4—7月)都符合WHO制定的SARS確診標(biāo)準(zhǔn),包括發(fā)熱(體溫≥38℃)、咳嗽或氣短,胸片示新近出現(xiàn)的肺內(nèi)陰影,以及與SARS患者有接觸史或廣譜抗生素治療無(wú)效。血清學(xué)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)結(jié)果顯示6例患者中有4例新近感染過(guò)SARS冠狀病毒。患者的臨床情況:6例尸檢患者男性5例,女性1例。年齡分別為51、50、31、49、24和58歲,平均43.8歲。病程(發(fā)熱到死亡時(shí)間)分別為44、47、55、35、33和90d,平均50.7d。除1例因患精神分裂癥未用激素治療,其余5例均曾應(yīng)用激素治療。研究方法:6例SARS患者的尸解肺標(biāo)本被分成4塊:1塊作病毒學(xué)研究,1塊-70℃冰箱保存,1塊用4%的中性甲醛固定,1塊用2.5%的戊二醛固定以用于透射電鏡檢查。采用光鏡和電鏡觀察肺標(biāo)本。免疫組織化學(xué)染色采用EnVision方法。甲醛固定、石蠟包埋的肺組織以4μm的厚度切片,并逐級(jí)脫蠟。分別染AE1/AE3(角蛋白,1∶50)、CD3(T細(xì)胞,1∶50)、CD68(巨噬細(xì)胞,1∶50)、CD20(B細(xì)胞,1∶50)、CD45RO(T細(xì)胞,1∶50)、平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA,1∶50)、Ⅰ和Ⅲ型膠原(1∶50),均為Dako公司生產(chǎn)的單克隆抗體。采用VentanaNexes自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色儀進(jìn)行染色。此外,對(duì)肺組織還進(jìn)行了Masson三色染色。免疫組織化學(xué)染色患者的肺標(biāo)本的病理形態(tài)改變總結(jié)如下。1.6例患者均存在雙肺彌漫性實(shí)變病灶,伴雙肺重量增加(1355~2226g)。肺明顯水腫,切面可見(jiàn)灰白色實(shí)變區(qū)。病灶不規(guī)則,呈斑片狀,直徑從幾毫米到幾厘米。支氣管管腔內(nèi)可見(jiàn)黏液膿性滲出物。2.6例患者均有彌漫性肺損傷性病變,包括透明膜形成(圖1)、肺泡腔內(nèi)水腫(水腫液呈顆粒狀或空泡狀)/出血、纖維素沉積和肺泡上皮細(xì)胞脫屑。采用AE1/AE3免疫組織化學(xué)染色顯示肺泡上皮的完整性明顯破壞(6/6)。3.部分輕度增生的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞有一定異型性,細(xì)胞體積增大,胞質(zhì)呈雙染性,顆粒狀,胞核增大,單核、雙核、多核,空泡狀,有明顯核仁,核形不規(guī)則,胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)細(xì)小空泡聚集和玻璃樣變性的小體形成(5/6),并被AE1/AE3免疫組織化學(xué)染色所證實(shí)(圖2)。4.6例患者中有5例的肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)巨細(xì)胞形成(圖3),這些巨細(xì)胞大多AE1/AE3免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性(5/6),少數(shù)CD68染色陽(yáng)性(2/6)。5.CD68免疫組織化學(xué)染色顯示6例患者的肺泡腔內(nèi)和肺泡間隔內(nèi)的巨噬細(xì)胞明顯增多(6/6)。此外,5例患者可見(jiàn)巨噬細(xì)胞噬紅細(xì)胞象(5/6、圖4)。然而,除了1例肺組織中浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞較多外(患者未接受激素治療),其他5例肺中浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞很少。6.6例患者中有5例可見(jiàn)明顯的肺纖維化(5/6),包括肺泡間隔和肺間質(zhì)明顯增厚(5/6),肺泡內(nèi)滲出物機(jī)化(成纖維細(xì)胞栓或腎小球樣小體形成)(6/6)和胸膜增厚(4/6)。這些成纖維細(xì)胞栓呈細(xì)長(zhǎng)形或腎小球樣,表現(xiàn)為淡染的基質(zhì)中散在少量梭形或星形的成纖維細(xì)胞(圖5)。Masson三色染色顯示膠原纖維增生(圖6),免疫組織化學(xué)染色證實(shí)大多數(shù)膠原纖維為Ⅲ型膠原,而Ⅰ型膠原纖維染色非常弱。光鏡和免疫組織化學(xué)染色證實(shí)5例患者有顯著的成纖維細(xì)胞/肌纖維母細(xì)胞增生灶形成(5/6),表現(xiàn)為黏液樣細(xì)胞外基質(zhì)中可見(jiàn)彌漫散在或小灶狀的成纖維細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞聚集,并被SMA免疫組織化學(xué)染色所證實(shí)。7.5例患者可見(jiàn)支氣管黏膜的鱗狀上皮化生(5/6),所有患者肺小血管內(nèi)均可見(jiàn)纖維素性微血栓形成(6/6),甚至部分患者較大的肺血管內(nèi)亦可見(jiàn)血栓形成。2例患者伴有其他病原體感染,一例是細(xì)菌感染,另一例是真菌感染。此外,電鏡顯示患者肺泡上皮細(xì)胞和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)和擴(kuò)張的細(xì)胞器內(nèi)可見(jiàn)直徑約100nm的圓形或橢圓形冠狀病毒樣顆粒,病毒顆粒的表面有特征性的放射冠。mems—討論6例SARS患者的病理形態(tài)改變顯示SARS肺病變的本質(zhì)是彌漫性肺泡損傷(DAD)。感染性因素可以導(dǎo)致DAD(尤其是病毒感染),因此,我們推測(cè)SARS-CoV由呼吸道進(jìn)入人體,在呼吸道黏膜上皮、肺泡上皮細(xì)胞和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并直接損傷肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞,從而嚴(yán)重?fù)p傷呼吸膜的血?dú)馄琳系耐暾?同時(shí)伴有炎癥性充血,引起漿液和纖維蛋白原的大量滲出,滲出的纖維蛋白原凝集成纖維素,進(jìn)而與壞死的肺泡上皮細(xì)胞碎屑共同形成透明膜,從而導(dǎo)致DAD的發(fā)生。與一般病毒性肺炎所致的間質(zhì)性肺炎不同,SARS患者肺泡間隔內(nèi)浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞很少,并且肺泡腔內(nèi)有多量漿液和纖維素滲出,提示在SARS肺病變的致病機(jī)制中,SARS-CoV不僅直接嚴(yán)重地?fù)p傷肺組織,且嚴(yán)重破壞細(xì)胞免疫系統(tǒng)。由于病程較長(zhǎng)(1~2個(gè)月),這6例SARS患者可見(jiàn)到DAD的3期病變(包括炎癥期或滲出期、增殖期和纖維化期)。其中1病程較短患者的主要病變是炎癥和滲出。雖然其他5例患者的肺病變主要是增殖期,甚至是纖維化期,但是在主要病變的周圍仍可見(jiàn)到炎癥和滲出;此外,RT-PCR在尸解肺標(biāo)本中檢測(cè)出SARS-CoVRNA,且電鏡在尸解肺組織中發(fā)現(xiàn)較多量冠狀病毒樣顆粒,這些都提示SARS-CoV在持續(xù)起作用。一些因素可能與SARS-CoV的持續(xù)作用有關(guān)。我們和其他研究都顯示SARS患者存在嚴(yán)重的淋巴細(xì)胞減少癥,肺泡間隔內(nèi)浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞較少,脾臟、全身淋巴結(jié)明顯萎縮(尤其是T細(xì)胞數(shù)明顯減少),這些都提示SARS-CoV嚴(yán)重?fù)p傷淋巴細(xì)胞,尤其是T細(xì)胞。一些研究證實(shí)病毒可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的凋亡。此外,治療SARS過(guò)程中激素的應(yīng)用可能在抑制淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)中起一定作用,并被我們的研究所證實(shí)。我們發(fā)現(xiàn)未用激素治療的患者的肺組織中浸潤(rùn)的CD3(+)淋巴細(xì)胞較其他5例明顯增多,考慮與激素抑制細(xì)胞免疫的副作用有關(guān),我們還發(fā)現(xiàn)這6例SARS患者的肺泡腔內(nèi)和肺泡間隔內(nèi)的巨噬細(xì)胞明顯增多,并被CD68免疫組織化學(xué)染色所證實(shí)。Cheung等發(fā)現(xiàn)被感染了H5N1A型流感病毒的巨噬細(xì)胞可釋放前致炎因子,以上提示在SARS致病機(jī)制中,發(fā)揮主要效應(yīng)的白細(xì)胞是巨噬細(xì)胞,而非淋巴細(xì)胞。雖然SARS患者肺內(nèi)浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞明顯增多,但其殺傷病毒的能力可能很弱。Collins發(fā)現(xiàn)人冠狀病毒OC43可在體外培養(yǎng)的人巨噬細(xì)胞內(nèi)繁殖。一些研究顯示實(shí)驗(yàn)用貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)可通過(guò)抗體依賴性增強(qiáng)反應(yīng)而加重感染,針對(duì)FIPV疫苗所產(chǎn)生的抗體可以與病毒結(jié)合,妨礙其被巨噬細(xì)胞吞噬,因此該病毒可以在巨噬細(xì)胞內(nèi)繁殖。另外,SARS肺組織中可見(jiàn)巨噬細(xì)胞噬紅細(xì)胞象,提示細(xì)胞因子功能紊亂。綜上所述,T細(xì)胞明顯凋亡、巨噬細(xì)胞殺傷病毒的能力減弱和所分泌的細(xì)胞因子功能紊亂以及激素的應(yīng)用可導(dǎo)致SARS-CoV的持續(xù)作用。除了DAD之外,SARS肺病變的另一顯著特點(diǎn)是肺泡上皮細(xì)胞輕度增生,并有一定的異型性,表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大,胞質(zhì)呈雙染性、顆粒狀,以及胞核增大。冠狀病毒在肺泡上皮細(xì)胞胞質(zhì)中的Golgi器內(nèi)組裝,并且體外細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)受冠狀病毒感染的細(xì)胞明顯水腫和胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)顆粒數(shù)明顯增多。因此我們推測(cè)SARS患者肺泡上皮細(xì)胞呈雙染性很可能是由于病毒顆粒在Golgi器內(nèi)組裝所致,電鏡所見(jiàn)就證實(shí)了這一點(diǎn)。SARS肺組織中經(jīng)?？梢?jiàn)巨細(xì)胞浸潤(rùn)。我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)巨細(xì)胞都是上皮細(xì)胞源性,只有少數(shù)細(xì)胞是巨噬細(xì)胞源性。一些動(dòng)物性冠狀病毒可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞融合,而SARS-CoV病毒可誘導(dǎo)Vero細(xì)胞融合形成合體細(xì)胞。這都提示巨細(xì)胞的形成是SARS-CoV病毒直接作用的結(jié)果。在我們的研究中,SARS肺病變最突出的特點(diǎn)是肺纖維化,包括肺泡間隔和肺間質(zhì)明顯增厚、肺泡腔內(nèi)滲出物機(jī)化(形成成纖維細(xì)胞栓或腎小球樣小體)、膠原纖維堆積和顯著的成纖維細(xì)胞/肌纖維母細(xì)胞增生灶形成。SARS患者中的肺纖維化相當(dāng)于DAD的機(jī)化期。其發(fā)病過(guò)程是肺泡上皮細(xì)胞的損傷和活化、上皮細(xì)胞下成纖維細(xì)胞/肌纖維母細(xì)胞顯著增生和細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)量堆積。彌漫性肺間質(zhì)纖維化的機(jī)制:(1)炎癥性通路;(2)上皮性通路。越來(lái)越多的證據(jù)顯示肺泡上皮細(xì)胞的破壞是啟動(dòng)肺間質(zhì)纖維化的一個(gè)重要因素。我們的研究發(fā)現(xiàn)SARS患者肺泡上皮細(xì)胞的完整性明顯破壞和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞輕度增生,并被AE1/AE3免疫組織化學(xué)染色所證實(shí);此外,SARS肺病變中炎癥反應(yīng)很輕,提示在SARS肺纖維化致病機(jī)制中,上皮性通路所起的作用較炎癥性通路更為重要。我們推測(cè)SARS-CoV直接損傷肺泡上皮細(xì)胞,導(dǎo)致Ⅰ型肺泡細(xì)胞脫屑,進(jìn)而誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞活化。肺泡細(xì)胞釋放多種細(xì)胞因子/生長(zhǎng)因子,誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞遷移進(jìn)入肺泡腔、增殖和發(fā)生細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化(肌纖維母細(xì)胞),進(jìn)而導(dǎo)致肺泡腔內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的堆積。此外,肌纖維母細(xì)胞增生灶可啟動(dòng)不可逆的肺纖維化進(jìn)程。繼肌纖維母細(xì)胞增生之后,細(xì)胞外基質(zhì)異常塑型,進(jìn)而肺結(jié)構(gòu)破壞和肺纖維化。Uhal等發(fā)現(xiàn)肌纖維母細(xì)胞可合成明膠酶A和B,這兩種基質(zhì)金屬蛋白酶可降解基底膜,導(dǎo)致Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞修復(fù)障礙,并促進(jìn)成纖維細(xì)胞/肌纖維母細(xì)胞遷移進(jìn)入肺泡腔。研究證實(shí)成纖維細(xì)胞/肌纖維母細(xì)胞的數(shù)量與肺纖維化患者的預(yù)后關(guān)系密切。我們的研究發(fā)現(xiàn)SARS患者的肺組織中有明顯的成纖維細(xì)胞/肌纖維母細(xì)胞增生灶,提示SARS肺纖維化機(jī)制與其他肺纖維化性疾病很相似。再者,SARS患者的肺泡腔內(nèi)和肺泡間隔內(nèi)巨噬細(xì)胞明顯增多,提示巨噬細(xì)胞在SARS肺纖維化機(jī)制中有一定作用。Taylor等發(fā)現(xiàn)肺巨噬細(xì)胞可釋放炎癥介質(zhì),促進(jìn)炎細(xì)胞聚集、成纖維細(xì)胞增生和膠原纖維沉積。我們的研究還發(fā)現(xiàn)SARS患者肺內(nèi)Ⅲ型膠原合成較Ⅰ型膠原明顯增多。VanHoozen等發(fā)現(xiàn)肺纖維化疾病患者的血清或肺泡灌洗液中Ⅲ型前膠原肽N-末端的