氮、磷脅迫對(duì)穗花狐尾藻酚類物質(zhì)的影響

氮、磷脅迫對(duì)穗花狐尾藻酚類物質(zhì)的影響

1水生態(tài)系統(tǒng)生物活性成分研究隨著國內(nèi)外水體富營養(yǎng)化進(jìn)程的加快，富營養(yǎng)化水體的控制和管理已成為國內(nèi)外科學(xué)家的中心對(duì)象。水生植物對(duì)浮生植物的化感抑制作用越來越受到關(guān)注。化感作用是植物之間常見的化學(xué)生態(tài)現(xiàn)象，是植物在進(jìn)化過程中對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性機(jī)制。水下植物和浮生植物是水生態(tài)系統(tǒng)的主要初始原因。研究表明，水生植物和藻類之間存在明顯的化感作用（hilt等人，2008）。一些從眼中水生植物，如黃色素、馬鞭草、甘薯和日本山楂，在銅綠甲殼類、斜生紫草和山羊明月藻中產(chǎn)生了一定的抑制作用（吳曉輝，2005；張盛華，2007）。nakai等人（1999）通過初始和半連續(xù)注射實(shí)驗(yàn)證明，水生植物通過持續(xù)釋放化感物質(zhì)來抑制藻類的生長。rice（1984）認(rèn)為，植物的化感物質(zhì)主要來自植物的二級(jí)代謝，并根據(jù)它們的原生代謝進(jìn)行分析。例如，在水生植物的化感作用研究中，在惡劣的條件下，如低氮、少磷、低溫暴露、紫外輻射和雜草入侵等條件下，可以提高水稻的化感效果（zhanga等人，2005）。這種化感潛力的變化可能是由于環(huán)境因素的影響。例如，水生態(tài)系統(tǒng)中水生植物的化感作用也可能受到環(huán)境因素的影響。目前，水生態(tài)系統(tǒng)的評(píng)價(jià)主要集中在兩個(gè)方面。一是研究水生植物對(duì)藻類的化感反應(yīng)反應(yīng)，并研究水生植物的相應(yīng)亞化代謝與生物代表代謝之間的關(guān)系。例如，關(guān)于水生態(tài)系統(tǒng)中水生植物的化感、化感活動(dòng)的提取、分離和鑒定（zhuetal.2010；wangetal.2010），但在環(huán)境條件下，很少有關(guān)于水生植物化感物質(zhì)、生物化學(xué)活動(dòng)和相關(guān)二級(jí)代謝與一級(jí)代謝之間的關(guān)系的報(bào)告。因此，環(huán)境因子對(duì)水下植物、化感活動(dòng)的變化和變化機(jī)的研究不僅對(duì)理解環(huán)境條件下的水下植被演變起到重要作用，而且對(duì)恢復(fù)富營養(yǎng)化水體的水下植被具有重要的技術(shù)指導(dǎo)作用。穗花狐尾藻(Myriophyllumspicatum)是一種常見的沉水植物,耐污染能力較強(qiáng),常常是水生植被恢復(fù)中優(yōu)先考慮的先鋒物種(李偉等,2000).研究發(fā)現(xiàn),穗花狐尾藻分泌的化感物質(zhì)主要是酚酸類物質(zhì),且對(duì)兩種常見水華藍(lán)藻有比較強(qiáng)的抑制作用(Nakaietal.,1999;2000;Grossetal.,1996;2009).因此,本文以穗花狐尾藻為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,研究不同氮、磷營養(yǎng)水平下穗花狐尾藻體內(nèi)的初生代謝物及次生代謝物———總酚類化感物質(zhì)的變化,探討不同氮、磷營養(yǎng)水平對(duì)穗花狐尾藻體內(nèi)化感物質(zhì)的影響及其與初生代謝物之間的關(guān)系,以期為富營養(yǎng)化水體的水生植物恢復(fù)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).2材料和方法表面活性劑2.1miiii法培養(yǎng)生長植株穗花狐尾藻(Myriophyllumspicatum)采自湖北洪湖,采集時(shí)間為2010年8月.用自來水沖洗葉片上吸附的泥沙和其他雜質(zhì)后,截取25cm長的植株于室外有底泥的玻璃缸中擴(kuò)大培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)前一周轉(zhuǎn)入室內(nèi)用改良的MIII培養(yǎng)液(K9rneretal.,2002)適應(yīng)培養(yǎng),每3d更換一次培養(yǎng)液.1周后,挑選生長良好的植株用蒸餾水沖洗并吸干水分,設(shè)置生物量為8g·L-1置于玻璃缸(27.5cm×13.5cm×21.5cm,長×寬×高)中培養(yǎng).分別以MIII培養(yǎng)液中氮、磷濃度為對(duì)照,按高低各設(shè)置兩個(gè)濃度梯度,通過調(diào)節(jié)NaNO3和KH2PO4的加入量控制培養(yǎng)液中氮、磷的濃度,培養(yǎng)液其他成分與MIII相同.氮濃度分別為0.875、7.0、56.0mg·L-1,由低到高分別用LN、CN、HN表示;磷濃度分別為0.194、1.55、12.4mg·L-1,由低到高分別用LP、CP、HP表示,其中,CN、CP為MIII培養(yǎng)液中氮、磷的水平.每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行,培養(yǎng)條件為25℃,光暗比12h∶12h,光強(qiáng)為6000lx,實(shí)驗(yàn)周期為7d.7d后穗花狐尾藻自培養(yǎng)液中被取出并快速吸干表面水分,截取頂端組織并分為兩部分,一部分放入低溫冰箱中冷凍保存,另一部分經(jīng)低溫冰箱冷凍后,放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)冷凍干燥至恒重,然后研磨成粉末,放入冰箱保存.2.2可溶性糖、pal酶活性的測定測試指標(biāo)為生物量、頂端組織中可溶性蛋白、可溶性糖、苯丙氨酸裂解酶(Phenylalanineammonialyase,PAL)及總酚.生物量的測定方法:室溫下,在桌上鋪一張吸水紙,將植株從水中撈出后均勻鋪在吸水紙上,然后另取一張吸水紙鋪在植株上,輕輕按壓,約5s后稱重.可溶性蛋白、可溶性糖、PAL酶的提取與測定均參考《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)》上的方法(李合生等,2000),可溶性蛋白采用考馬斯亮藍(lán)法測定,可溶性糖采用蒽酮硫酸法測定,PAL酶活性的測定以每小時(shí)在290nm處吸光度變化0.01所需酶量為1個(gè)單位,用U表示.總酚提取方法:稱取一定量冷凍干燥后研磨成粉末的樣品于研缽中,用80%的丙酮(色譜純)按6mL∶0.1g的比例研磨均勻后,搖床振蕩2h,10000r·min-1下離心10min,倒出上清液,殘?jiān)侔瓷鲜霾襟E提取一次,合并上清液,低溫旋轉(zhuǎn)蒸干后,用色譜純甲醇按0.1g·mL-1(以干重計(jì))定容.總酚的測定用改良后的FFlin-Ciocalteau法(Singletonetal.,1999;Hiltetal.,2006).2.3數(shù)據(jù)分析及分析所有指標(biāo)均取3次或3次以上的平均值,并求出標(biāo)準(zhǔn)差,采用SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,顯著性差異分析采用One-wayANOVA分析方法.3結(jié)果和分析結(jié)果和分析3.1花東南角型穗花生物養(yǎng)殖水平不同氮、磷條件下穗花狐尾藻生物量增長率的變化見圖1.從圖1可以看出,作為對(duì)照組的MIII培養(yǎng)條件下(CN、CP)穗花狐尾藻生物量增長率相對(duì)較高;低氮和高氮處理水平的穗花狐尾藻生物量增長率與對(duì)照相比分別降低了15.38%和24.23%;低磷和高磷處理組與對(duì)照組相比分別降低了23.11%和12.91%;高氮條件下穗花狐尾藻生物量增長率與對(duì)照組相比表現(xiàn)出顯著差異(p<0.05).結(jié)果表明,不管是低的氮、磷濃度還是高的氮、磷濃度都會(huì)降低穗花狐尾藻的生物量增長率.3.2高氮水平下可溶性糖含量不同氮、磷濃度下穗花狐尾藻頂端組織中可溶性糖含量變化如圖2所示.由圖2可知,低氮水平下,頂端組織中可溶性糖含量為50.91mg·g-1(以干重計(jì)),比對(duì)照組高22.26%,且有顯著性差異(p<0.05);高氮水平下可溶性糖含量為34.17mg·g-1(以干重計(jì)),比對(duì)照低17.94%;低磷水平下穗花狐尾藻頂端組織中可溶性糖含量為38.25mg·g-1(以干重計(jì)),比對(duì)照組高12.73%,高磷水平下穗花狐尾藻頂端組織中可溶性糖含量與對(duì)照組相差不大.總體上看,不同氮水平下穗花狐尾藻頂端組織中可溶性糖含量表現(xiàn)為隨氮濃度升高而降低的趨勢.與不同氮處理水平相比,不同磷濃度對(duì)可溶性糖含量影響較小,表現(xiàn)為只有低磷水平下,穗花狐尾藻頂端組織中可溶性糖含量比對(duì)照組高.穗花狐尾藻頂端組織中可溶性糖含量對(duì)不同氮濃度的響應(yīng)比對(duì)不同磷濃度的響應(yīng)更為敏感.3.3可溶性蛋白含量不同氮、磷水平下穗花狐尾藻頂端組織中可溶性蛋白含量變化如圖3所示.由圖3可知,不同氮水平下,穗花狐尾藻頂端組織中可溶性蛋白含量按氮水平由低到高的順序分別為13.28、14.03、14.29mg·g-1(以鮮重計(jì)).不同磷水平下,穗花狐尾藻頂端組織中可溶性蛋白含量按磷水平由低到高的順序分別為14.19、14.75、15.47mg·g-1(以鮮重計(jì)).統(tǒng)計(jì)分析表明,不同氮、磷水平下,穗花狐尾藻頂端組織中可溶性蛋白含量與對(duì)照組相比沒有顯著差異.3.4低氮處理對(duì)穗花織物頂組織pal酶活性的影響不同氮、磷水平下穗花狐尾藻頂端組織中PAL酶的活性(以鮮重計(jì))如圖4所示.由圖4可知,3組不同氮處理?xiàng)l件下,低氮處理的穗花狐尾藻頂端組織中,PAL酶活性最強(qiáng),與對(duì)照相比提高了68.52%,表現(xiàn)出顯著差異(p<0.01);高氮水平下穗花狐尾藻頂端組織中PAL酶活性比對(duì)照高10.61%,沒有顯著性差異.低磷水平和高磷水平下,穗花狐尾藻頂端組織中PAL酶活比對(duì)照分別高36.64%和16.01%,差異顯著(p<0.01).3.5低氮水平對(duì)穗花織物頂組織總酚含量的影響不同氮、磷水平下穗花狐尾藻頂端組織中總酚的含量如圖5所示.由圖5可知,不同氮濃度水平下,穗花狐尾藻頂端組織中總酚含量按氮水平由低到高的順序分別為44.74、24.42、29.73mg·g-1(以干重計(jì)),低氮水平下穗花狐尾藻頂端組織中總酚含量與對(duì)照相比提高了83.20%,有顯著差異(p<0.01);高氮水平下穗花狐尾藻頂端組織中總酚含量比對(duì)照高21.77%,有顯著差異(p<0.05).不同磷濃度水平下,穗花狐尾藻頂端組織中總酚含量按磷水平由低到高的順序分別為37.77、30.60、36.05mg·g-1(以干重計(jì)),低磷和高磷水平下穗花狐尾藻頂端組織中總酚含量與對(duì)照相比分別高23.43%和17.82%,但差異不顯著.4氮、磷脅迫對(duì)穗花生物活性的影響氮、磷是植物生長過程中必需的兩種大量礦質(zhì)元素,參與植物生命過程中的各種生理代謝活動(dòng).氮是植物體內(nèi)許多重要有機(jī)化合物如蛋白質(zhì)、葉綠素、核酸等的組成成分,多方面影響著植物的代謝和生長發(fā)育過程.磷是核酸、核蛋白、磷脂等活細(xì)胞內(nèi)多種功能性物質(zhì)的重要成分,與活細(xì)胞的能量代謝、有機(jī)物的合成和分解代謝、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控等過程密切相關(guān)(武維華,2003).本研究中,不同氮、磷濃度影響穗花狐尾藻的生物量,其中,MIII營養(yǎng)條件下穗花狐尾藻的生物量高于其他氮、磷水平的生物量.說明在本實(shí)驗(yàn)室條件下,MIII營養(yǎng)條件適宜穗花狐尾藻的生長,低營養(yǎng)條件由于營養(yǎng)供給不足而高營養(yǎng)條件會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生脅迫從而導(dǎo)致穗花狐尾藻生物量降低.劉燕等(2009)研究水體營養(yǎng)水平對(duì)沉水植物的生長時(shí)發(fā)現(xiàn),狐尾藻單株最大生物量在中營養(yǎng)水平下比富營養(yǎng)水平下高39%.黃玉源等(2011)在研究不同磷濃度對(duì)苦草的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),高濃度磷水平下苦草葉綠素含量和根系活力都降低,認(rèn)為高濃度磷會(huì)對(duì)苦草產(chǎn)生一定程度的毒害,導(dǎo)致光合作用受阻、植物根系受損,進(jìn)而影響苦草對(duì)礦質(zhì)離子的吸收及體內(nèi)的生物合成.本實(shí)驗(yàn)中同時(shí)觀察到在低氮和低磷條件下,穗花狐尾藻能產(chǎn)生相對(duì)較多的根,且根的長度也相對(duì)較長,隨著氮、磷濃度的升高,根的數(shù)量和長度明顯降低.這與穗花狐尾藻能在底質(zhì)N、P豐富而水體貧營養(yǎng)的系統(tǒng)中保持高的生長率的結(jié)論一致(Bestetal.,1978),也與Mantai和Newton(1982)關(guān)于如果底質(zhì)營養(yǎng)豐富,隨著水體中N、P濃度的升高,穗花狐尾藻的根和枝條的生長都明顯減少的結(jié)論一致.植物體內(nèi)的可溶性糖有重要的調(diào)控作用,而各種代謝的酶類是可溶性蛋白的重要組成部分.本實(shí)驗(yàn)中穗花狐尾藻頂端組織中可溶性糖含量隨著氮水平的升高呈降低趨勢,特別是低氮條件下,可溶性糖含量顯著高于對(duì)照組,可溶性蛋白含量隨著氮濃度的升高呈上升趨勢,但各處理組間的差異不明顯.這可能是由于穗花狐尾藻受到氮、磷脅迫后,體內(nèi)各種酶在種類和數(shù)量上雖然有差異,但表現(xiàn)在可溶性蛋白總量上區(qū)別不大.雖然不同磷濃度對(duì)穗花狐尾藻可溶性糖及可溶性蛋白含量的影響與不同氮濃度的影響有一致性,但穗花狐尾藻對(duì)氮濃度的響應(yīng)高于對(duì)磷濃度的響應(yīng).王斌等(2002)在研究不同氮、磷濃度水平下竹葉眼子菜的生理反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn),可溶性糖含量隨著氮、磷濃度的升高而降低,且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,缺氮、磷條件下可溶性糖含量升高到最大值后保持穩(wěn)定,而中營養(yǎng)、富營養(yǎng)及超富營養(yǎng)狀態(tài)下,可溶性糖含量略微升高后逐漸降低.劉燕等(2009)研究發(fā)現(xiàn),相較富營養(yǎng)水平,中富營養(yǎng)水平下狐尾藻體內(nèi)可溶性蛋白含量持續(xù)升高.這些與本研究結(jié)果基本一致.植物受到氮、磷營養(yǎng)限制時(shí),會(huì)積累可溶性糖,雖然具體機(jī)制還不清楚,但有研究者認(rèn)為在植物受到氮、磷營養(yǎng)限制時(shí),可溶性糖對(duì)植物體內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)換起關(guān)鍵作用,如Hermans等(2006)認(rèn)為植物幼苗在受到氮、磷營養(yǎng)限制時(shí),可能是植物葉片中可溶性糖的積累誘使某個(gè)代謝途徑的轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化,從而使植物體內(nèi)某些代謝發(fā)生改變.酚類化合物是穗花狐尾藻體內(nèi)產(chǎn)生的一種重要的化感物質(zhì),一般認(rèn)為主要是通過苯丙烷類代謝途徑合成,其生物合成的起始分子是莽草酸途徑生成的苯丙氨酸(Vogt,2010).苯丙氨酸裂解酶(PAL)是苯丙烷代謝中心途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶和限速酶,它與植物體內(nèi)氮代謝密切相關(guān),負(fù)責(zé)合成酚類物質(zhì)的前體,是初生代謝與次生代謝的分支點(diǎn).PAL酶的合成及活性極易受到外界因素如植物激素、營養(yǎng)水平、光照長短、病菌、機(jī)械損害等的影響(Dixonetal.,2002).Kovácˇik等(2007)研究發(fā)現(xiàn),氮限制條件下,洋甘菊植物葉片中的PAL酶在4~8d內(nèi)活性逐漸增強(qiáng),而后隨時(shí)間的延長而降低.本實(shí)驗(yàn)體系中,穗花狐尾藻PAL酶活性對(duì)不同氮、磷條件的響應(yīng)與酚類化合物的變化表現(xiàn)出一致性,因此,可以理解為不同的氮磷脅迫誘導(dǎo)了PAL酶活增強(qiáng),從而使穗花狐尾藻體內(nèi)苯丙烷代謝中心途徑速度加快,更多的初生代謝物質(zhì)(如可溶性糖類等)轉(zhuǎn)化成為次生代謝的前體,在植物體更多代謝途徑的參與下合成更多的次生代謝物.同時(shí)發(fā)現(xiàn)低氮、磷和高氮、磷水平下的穗花狐尾藻頂端組織中總酚含量都比對(duì)照高,特別是低氮水平下與對(duì)照相比表現(xiàn)出顯著差異(p<0.01).這一結(jié)果結(jié)合生物量的變化也印證了植物化感作用的碳氮營養(yǎng)平衡假說(CarbonNutrientBalance,CNB),即認(rèn)為快速生長的植物在受到營養(yǎng)脅迫時(shí),植物生長放慢,植物體內(nèi)次生代謝物質(zhì)增加(Bryantetal.,1983).本研究中,雖然氮、磷脅迫都可以導(dǎo)致穗花狐尾藻體內(nèi)酚酸類化感物質(zhì)的增加,但相對(duì)磷濃度的作用,低氮脅迫更易引起植株體內(nèi)酚酸類物質(zhì)的增加.這可能是由于與磷代謝相比,苯丙烷類代謝途徑與氮代謝更密切相關(guān).TrondLue54fvdal等(2010)研究氮素供應(yīng)量、溫度和光照3個(gè)環(huán)境因子對(duì)西紅柿葉片中酚酸含量和相關(guān)基因表達(dá)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),相對(duì)另外兩個(gè)環(huán)境因子,低氮脅迫更能導(dǎo)致西紅柿葉片中酚酸含量的提高,這主要是由于低氮脅迫導(dǎo)致了與PAL有關(guān)的ANT1(ANTHOCYANIN1)和SIJAF13(abHLHtranscriptionfactororthologueofpetuniaJAF13andmaizeREDgenes)的大量表達(dá).Gross的(1996;2003)研究結(jié)果也認(rèn)為營養(yǎng)水平降低可以影響穗花狐尾藻產(chǎn)生化感物質(zhì)的過程,同時(shí)還發(fā)現(xiàn)與生長在氮充足條件下的穗花狐尾藻相比,氮限制條件下的無菌穗花狐尾藻植株總酚和特里馬素II的含量都要高.何華勤等(2006)的研究結(jié)果也表明逆境和輻射等環(huán)境脅迫下,植物釋放化感物質(zhì)的種類和數(shù)量也會(huì)增加.Mckey等(1978)的研究證實(shí)大多數(shù)草本和木本植物在環(huán)境脅迫