3種植物mak基因的序列變異及系統(tǒng)發(fā)育分析

3種植物mak基因的序列變異及系統(tǒng)發(fā)育分析

紅杉科taxaceae有五個屬，即紅杉、白豆杉、澳大利亞紅杉、桑蠶、澳大利亞紅杉、雞葉楓和蒙古紅杉（fuetal.1999，cope1998）。除單型屬Austrotaxus僅分布于新喀里多尼亞(NewCaledonia)島外,其它4屬均分布于北半球。單型屬Pseudotaxus特產(chǎn)于中國東南部,Amentotaxus在第三紀(jì)時曾分布于歐亞大陸及北美(Florin1963),現(xiàn)主產(chǎn)于中國中部、南部及西南地區(qū)。三尖杉科Cephalotaxaceae僅含三尖杉屬Cephalotaxus,產(chǎn)于亞洲東部至南亞次大陸。紅豆杉科與三尖杉科間的關(guān)系、紅豆杉科是否為一個單系群及科內(nèi)屬間關(guān)系一直存在極大的爭議(葉能干等1996,張君增等1996,Lin&Wang1994,管啟良等1993,Huetal.1992,Wang&Chen1990,Hart1987,胡志昂等1986,席以珍1986a,1986b,馬忠武等1986,1985,何關(guān)福等1983,Wilde1975,Keng1975,1960,Chuang&Hu1963,Li1952,Buchholz1940,Saxton1934,Sahni1920)。特別是Amentotaxus曾被置于羅漢松科Podocarpaceae、三尖杉科(Koidzumi1942,Pilger1926)、獨立成科(Kudo&Yamamoto1931)或被建議提升為科(Xi1986a,1986b,Chuang&Hu1965)。上述爭議源于紅豆杉科與三尖杉科部分形態(tài)性狀的平行演化(Fiordietal.1996)及一些類群生殖器官形態(tài)的簡化(Wilde1975,Florin1948)。雖然結(jié)合營養(yǎng)及生殖器官特征很容易對現(xiàn)存紅豆杉科各屬加以區(qū)分,但能用于探討該科系統(tǒng)發(fā)育問題的可靠性狀卻很少(Ferguson1978),不同學(xué)者強(qiáng)調(diào)的性狀不同,因而得出完全不同的結(jié)論。隨著近年來分子系統(tǒng)學(xué)的迅猛發(fā)展,有些學(xué)者開展了裸子植物的分子系統(tǒng)發(fā)育重建工作(Stefanovicetal.1998,Chawetal.1997,1995,Tsumuraetal.1995),但由于取樣代表性不足及所選基因的分辨率不夠等原因,紅豆杉科及三尖杉科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系仍為未解之謎。matK基因是葉綠體基因組中進(jìn)化速率最快的基因之一,其序列變異具有系統(tǒng)發(fā)育信息(Hilu&Liang1997),適用于研究近緣科間及科內(nèi)屬間關(guān)系(汪小全洪德元1997)。本文報道基于該基因序列構(gòu)建的紅豆杉科及三尖杉科的唯一最簡約樹。1材料和方法1.1strobyus因缺乏材料而未涉及的科實驗材料涉及紅豆杉科4屬6種(Austrotaxus因得不到材料而未包括在本研究中)、三尖杉科2種、羅漢松科2屬2種及松科2屬3種(表1)。1.2提取的dna用于DNA提取的材料為新鮮或硅膠干燥的針葉,提取方法為CTAB法(Rogers&Bendich1988)。1.3trnk基因pcr及測序由于matK基因位于trnK基因的內(nèi)含子中,且進(jìn)化速率很快,引物較難設(shè)計。我們首先用引物trnK-3914F(5′GGGGTTGCTAACTCAACGG3′)及trnK-2R(5′AACTAGTCGGATGGAGTAG3′)(Johnson&Soltis1995)擴(kuò)增得trnK基因。擴(kuò)增反應(yīng)在PE9600型PCR儀上進(jìn)行,反應(yīng)體積為50μl,程序為:70℃,4min→94℃,1min;50℃,20s;72℃,2.5min;2個循環(huán)→94℃,20s;50℃,20s;72℃,2.5min;38個循環(huán)→72℃,4min。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后用于測序反應(yīng),序列分析在ABI377自動測序儀上完成。根據(jù)trnK-3914F及trnK-2R測得的序列逐步設(shè)計出內(nèi)引物trnKF1(5′TACTGATCAGAAGTTAAGAGC3′),matK-TR1(5′ATTCGATCGAATCGATCGAG3′),matK-TF1(5′AATCATAGATCTTGGCAACAAT3′)及matKF511(5′TTTCGTCGCTGGATCCGAG3′)。通過上述6個引物測得完整的trnK基因序列。1.4數(shù)據(jù)分析1.4.1matk基因序列及系統(tǒng)發(fā)育重建在測定的約2.4kb的trnK基因序列中,trnK的5′及3′端外顯子與matK基因間的序列在科間變異較大(排序較為困難)。本文僅選擇matK基因序列用于系統(tǒng)發(fā)育重建及基因進(jìn)化規(guī)律的分析。DNA排序通過ClustalW(Thompsonetal.1994)軟件完成,然后手工作適當(dāng)調(diào)整。1.4.2羅漢松科、三尖杉科的外類考慮到Amentotaxus曾被置于羅漢松科或三尖杉科,本文又要討論紅豆杉科是否為單系群這一問題及Nageia的系統(tǒng)位置,因而羅漢松科和三尖杉科均不能作為外類群。已有證據(jù)表明松科為一單系群,且位于松柏綱的基部(Stefanovicetal.1998,Chawetal.1997)。本文從松科的兩大支中選擇北美短葉松Pinusbanksiana、華山松Pinusarmandi及遼東冷杉Abiesholophylla作為外類群。1.4.3缺隙ph處理系統(tǒng)樹的構(gòu)建及遺傳距離的計算由PAUP3.1.1系統(tǒng)發(fā)育分析軟件完成(Swofford1993),缺隙(gap)處理作缺失(missing)狀態(tài)。最簡約樹采用分支界線法(branch-and-bound)尋找。為進(jìn)一步判斷簡約樹中各分支的可信度,本文采用bootstrap檢驗方法(1000次重復(fù))。DNA序列變異的規(guī)律由MEGA(Version1.01)軟件分析完成(Kumaretal.1993)。2pseudolunimulactizar3-4,3位地鐵、3位表型的matk基因及測序本文測得各類群的trnK基因序列約2.4kb,其中matK基因的長度在類群間有較大差異(表2),測得的序列已存于GenBank中(AF143427,AF143428,AF143441,AF228103～AF228112)。排列后的matK序列長1568bp(用于PAUP分析的序列),含3、6、9bp的插入(或缺失)多個,且大多數(shù)插入(或缺失)具有系統(tǒng)發(fā)育信息;5′端的1494bp中,587bp(39.3%)發(fā)生變異,其中密碼子第1、2和3位的變異分別為190bp(32.3%)、166bp(28.3%)和231bp(39.4%)(1.14∶1∶1.39)。平均同義(synonymous)替代率(0.2272)是平均非同義(nonsynonymous)替代率(0.1249)的1.8倍。在一些類群(如Torreya,Cephalotaxus)的matK基因的3′端,因單堿基插入導(dǎo)致閱讀框的移動,這也是造成matK基因具較大長度變異的原因之一。此外,在Pseudotaxus的matK基因的213bp處(5′端)發(fā)現(xiàn)有一27bp長度的缺失。各類群間的遺傳距離見表3。分支界線法尋找僅得到一個最簡約樹(圖1),樹長為895步,一致性指數(shù)(CI)和維持性指數(shù)(RI)分別為0.850和0.876。簡約樹的各分支均得到bootstrap分析的極強(qiáng)支持。在該簡約樹中,紅豆杉科、三尖杉科和羅漢松科均為單系群,三尖杉科為紅豆杉科的姐妹群;紅豆杉科包括Taxus、Pseudotaxus、Amentotaxus及Torreya,Taxus為Pseudotaxus的姐妹群,Amentotaxus為Torreya的姐妹群。3討論3.1matk和rbcl基因的序列變異分布本研究的13種松柏類植物的matK基因密碼子1、2和3位的變異比率為1.14∶1∶1.39,即第3位的變異率最高,第1位的變異率次之,第2位的變異率最低,但3個位置的變異率還是較相近的。Wangetal.(1998)發(fā)現(xiàn)松科rbcL基因密碼子1、2和3位的變異比率為2.16∶1∶8.31,即第3位的變異率遠(yuǎn)高于第1和第2位。matK和rbcL變異分布上的這種顯著差異與Johnson&Soltis(1995)在虎耳草科Saxifragaceae的研究結(jié)果是一致的。他們發(fā)現(xiàn)該類群matK和rbcL基因密碼子1、2及3位的變異比率分別為1.22∶1∶1.57和1.26∶1∶6.17。matK和rbcL均為葉綠體基因組的蛋白編碼基因,前者的序列變異在密碼子3個位置無顯著偏差,且其3′端可因單堿基插入導(dǎo)致閱讀框移動,這些事實說明該基因所受的選擇壓遠(yuǎn)較rbcL基因所受的選擇壓低,適用于探討分子進(jìn)化問題,在系統(tǒng)學(xué)研究中將有廣泛應(yīng)用前景(雖然rbcL基因曾被廣泛用于科及科以上分類等級的系統(tǒng)發(fā)育研究)。此外,Wangetal.(2000)發(fā)現(xiàn)matK基因在松科中符合分子鐘進(jìn)化,是探討類群分化時間的一個良好分子標(biāo)記。3.2穗花杉科增加基因子Amentotaxus的模式種A.argotaenia曾被置于羅漢松屬Podocarpus中,后來基于雄球花的形態(tài)被移入Cephalotaxus(Li1952)。Pilger(1916)正式建立Amentotaxus后,關(guān)于該屬的分類等級(作為屬、族、亞科或獨立成科)及其系統(tǒng)位置(置于三尖杉科、紅豆杉科或羅漢松科)爭議頗多。Pilger(1926)將Amentotaxus置于三尖杉科;Kudo&Yamamoto(1931)將Amentotaxus獨立為穗花杉科Amentotaxaceae;Koidzumi(1932)不贊同該單型科的建立,主張建立穗花杉亞科Amentotaxoideae(含Amentotaxus及Austrotaxus)。Buchholz(1948)支持將Amentotaxus置于三尖杉科,而Florin(1948)認(rèn)為Amentotaxus與Cephalotaxus的大孢子葉球及氣孔有顯著差別,建議將Amentotaxus放回紅豆杉科。Janchen(1950)進(jìn)一步將Amentotaxus及Torreya置于紅豆杉科榧樹族Torreyeae中,并得到Li(1952)及Keng(1969)的支持。Chuang&Hu(1963)根據(jù)Amentotaxusargotaenia及A.formosana的染色體基數(shù)x=7(有別于Cephalotaxus和Taxusx=12,Torreyax=11)支持建立穗花杉科。陳祖鏗和王伏雄(1984)根據(jù)胚胎學(xué)研究將Amentotaxus和Austrotaxus置于穗花杉族。席以珍(1986a,1986b)從孢粉學(xué)角度支持Kudo&Yamamoto(1931)建立穗花杉科Amentotaxaceae的觀點。管啟良等(1993)發(fā)現(xiàn)Amentotaxusargotaenia的染色體數(shù)2n=40,結(jié)合隨體及次縊痕位置,支持將Amentotaxus置于羅漢松科。核基因組18SrDNA序列分析表明Amentotaxus為Torreya的姐妹群,但bootstrap分析對這一姐妹群關(guān)系的支持率低于90%(Chawetal.1997,1995),本文的matK基因序列分析有力支持該姐妹群關(guān)系(bootstrap值為100%)(圖1)。3.3最大限度和遺傳距離Pseudotaxus是鄭萬鈞1947年從Taxus中分出的單型屬(鄭萬鈞等1978),與Taxus的區(qū)別特征為假種皮白色、氣孔帶白色、小枝近對生或近輪生、球花基部的苞片交叉對生。該屬作為屬的等級及其系統(tǒng)位置尚存爭議。Pseudotaxus與Taxus的配子體發(fā)育、受精作用(陳祖鏗王伏雄1979)及胚胎發(fā)育(陳祖鏗王伏雄1978)特征很相似。相反,席以珍(1986a)發(fā)現(xiàn)二者的花粉特征相差甚遠(yuǎn),不僅支持Pseudotaxus作為屬的等級,而且建議將Pseudotaxus提升為白豆杉族Pseudotaxeae,并得到化學(xué)成分研究方面的支持(張君增等1996,馬忠武等1982)。周其興等(1998)通過等位酶分析支持白豆杉作為紅豆杉科中的一個屬。細(xì)胞學(xué)研究表明,Pseudotaxus與Taxus具相同的染色體數(shù)目(n=12)及相似的核型(顧志建等1998b)。在matK基因樹上,Pseudotaxus作為Taxus的姐妹群得到bootstrap分析的100%支持(圖1);兩屬間的遺傳距離為0.052,非常接近Torreya與Amentotaxus間的遺傳距離(0.042～0.045),遠(yuǎn)大于紅豆杉科種間遺傳距離(0.002～0.003)(表3)。此外,在Pseudotaxus的matK基因的213bp處(5′端)發(fā)現(xiàn)有一27bp長度的缺失。從遺傳距離的角度看,Pseudotaxus作為紅豆杉科的一個屬是合適的。3.4amenolhist.關(guān)于多源性的第5期2002年7月關(guān)于紅豆杉科的范圍、屬間關(guān)系及其與三尖杉科間的關(guān)系的爭論主要源于Amentotaxus及Pseudotaxus。Koidzumi(1942)認(rèn)為Amentotaxus與Cephalotaxus有很近的親緣關(guān)系,建議將紅豆杉科與三尖杉科合并,作為兩個亞科處理。陳祖鏗和王伏雄(1984)根據(jù)胚胎學(xué)研究將紅豆杉科分為3個族:穗花杉族(含Amentotaxus和Austrotaxus)、紅豆杉族(含Taxus和Pseudotaxus)及榧樹族(僅含Torreya)。馬忠武等(1985)根據(jù)雙黃酮成分在紅豆杉科各屬中的分布,對Amentotaxus和Pseudotaxus(不含雙黃酮成分)是否應(yīng)歸于紅豆杉科提出質(zhì)疑。席以珍(1986a,1986b)根據(jù)花粉形態(tài)及Amentotaxus花粉外壁的超微結(jié)構(gòu)建議將紅豆杉科分為兩個族,即白豆杉族(僅含Pseudotaxus)和紅豆杉族(含Taxus和Torreya),并支持將Amentotaxus提升為穗花杉科,置于羅漢松科和三尖杉科之間。胡志昂等(1986)根據(jù)種子蛋白多肽和針葉過氧化物酶,指出紅豆杉科和三尖杉科具有親緣關(guān)系,紅豆杉科內(nèi)的進(jìn)化趨勢是從Taxus、經(jīng)Pseudotaxus和Amentotaxus至Torreya。紅豆杉科和三尖杉科間的親緣關(guān)系也得到形態(tài)解剖學(xué)(周姜笑梅1992,Hu&Wang1989,王伏雄等1979)、胚胎學(xué)(Chen&Wang1992,1990)及細(xì)胞學(xué)(顧志建等1998a,陳可詠1995)研究的支持。葉能干等(1996)根據(jù)幼苗形態(tài)學(xué)特征指出紅豆杉科中族的劃分和屬的系統(tǒng)排列(從原始到進(jìn)化)應(yīng)為榧樹族(Torreya)、穗花杉族(Amentotaxus)、紅豆杉族(Austrotaxus,Taxus和Pseudotaxus)。Chawetal.(1997,1995)利用18SrDNA序列分析探討了裸子植物的系統(tǒng)發(fā)育問題,材料涉及紅豆杉科的3個屬及三尖杉屬等,結(jié)果紅豆杉科的3個屬不構(gòu)成一個單系群,且屬間關(guān)系未得到很好的分辨。本文的matK基因序列分析表明:紅豆杉科和三尖杉科均是單系的,并分別得到bootstrap分析的93%和100%支持;紅豆杉科應(yīng)將Amentotaxus和Pseudotaxus包括在內(nèi),Amentotaxus近緣于Torreya,Pseudotaxus近緣于Taxus;三尖杉科是紅豆杉科的最近姐妹群(圖1)。3.5不同科屬的提出,引起了本世紀(jì)后Nageia在《中國植物志》中被處理作羅漢松屬Podocarpus下的一個組(鄭萬鈞等1978)。該屬名由Gaertner于1788年建立。DeLaubenfels(1987)及Page(1988)確認(rèn)了Nageia屬名的合法性,指出該屬寬大的并具多脈的披針形葉在松柏類植物中是很獨特的,其n=13的染色體數(shù)目也明顯有別于其它近緣類群。因而他認(rèn)為Nageia是羅漢松科中一個非常自然的屬。傅德志(