大鼠肥胖、高脂血癥性脂肪性肝炎模型的建立

大鼠肥胖、高脂血癥性脂肪性肝炎模型的建立

肝脂性肝炎是由多種疾病和原因引起的以肝內(nèi)脂性硬化為主的病理狀態(tài)。近年來,隨著人民生活水平的提高,飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變,由肥胖、高脂血癥等所致的非酒精性脂肪肝及非酒精性脂肪性肝炎(NASH)有不斷上升的趨勢。目前認(rèn)為非酒精性脂肪肝、NASH不再是一種良性病變,它可以發(fā)展為肝纖維化、肝硬化而導(dǎo)致一系列嚴(yán)重并發(fā)癥,在此發(fā)展過程中,NASH是一個(gè)重要的中間環(huán)節(jié),因而早期認(rèn)識(shí)并治療NASH對阻止慢性肝病進(jìn)展和改善預(yù)后具有重要意義。但迄今為止,國內(nèi)外尚無NASH的動(dòng)物模型,這在一定程度上大大限制了對NASH的深入研究。為此,本研究通過改良大鼠高脂飲食配方建立肥胖、高脂血癥性脂肪性肝炎的動(dòng)物模型。1材料和方法1.1測定試劑和試劑膽固醇購自華美藥房試劑部。豬油自備。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)測定試劑盒購自申能公司的Diasys試劑。甘油三酯(TG)、總膽固醇(TCH)、游離脂肪酸(FFA)測定試劑盒購自執(zhí)誠公司的Randox試劑。白蛋白(A)測定試劑盒購自上海生物制品研究所?？偟鞍?TP)測定試劑盒購自Trace公司。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)雄性SD大鼠(體重150±10g,購自西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)。正常喂養(yǎng)一周后,隨機(jī)分為2組。正常組(n=9)普通飼料喂養(yǎng);模型組(n=10)喂高脂飼料,即普通飼料基礎(chǔ)上加10%豬油,2%膽固醇。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由飲水和進(jìn)食,分籠(每籠5只)飼養(yǎng)于20℃±2℃明暗各12h的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。于實(shí)驗(yàn)后12周處死二組動(dòng)物,方法為隔夜禁食,次日以2%戊巴比妥鈉溶液1mL/kg體重腹腔內(nèi)注射麻醉,從后腔靜脈采血后處死,迅速取出肝臟,按常規(guī)制備血清和肝組織石蠟切片及超薄切片標(biāo)本。2觀察指標(biāo)和方程式2.1一般情況下實(shí)驗(yàn)前稱體重一次,觀察食欲行為、狀態(tài)、毛發(fā)及動(dòng)物死亡情況;實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死動(dòng)物時(shí)稱量體重、肝臟濕重。2.2血清生化血清ALT、AST、A、TP、TG、TCH、FFA測定按試劑盒操作步驟,在全自動(dòng)生化分析儀(O1ympusAU1000)上測定。2.3慢性麻黃炎性病理及檢測方法中性福爾馬林固定肝標(biāo)本,石蠟切片進(jìn)行HE染色,光鏡下評估肝脂肪變性和炎癥活動(dòng)情況。肝細(xì)胞脂肪變性程度判斷標(biāo)準(zhǔn)見表1。炎癥活動(dòng)度計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)則參考1981年Knodell提出的慢性肝炎組織學(xué)活動(dòng)指數(shù)(HAI),并結(jié)合王泰齡等提出的慢性肝炎炎癥活動(dòng)計(jì)分方案,分為匯管區(qū)炎癥(P)、小葉內(nèi)炎癥(L)、碎屑?jí)乃?PN)及橋接壞死(BN,包括多小葉壞死)四項(xiàng),每項(xiàng)依病變程度分別計(jì)為1、2、3、4分,因?yàn)锽N、PN的嚴(yán)重度與預(yù)后直接相關(guān),故其計(jì)分2倍于其它病變,計(jì)分公式為P+L+2(PN+BN)。具體計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。2.4超微結(jié)構(gòu)觀察取肝組織塊切成約1mm3后,用2.5%戊二醛前固定,1%鋨酸后固定,漂洗,逐級(jí)脫水、浸透、固化,LKB-1型超薄切片機(jī)切片50~60nm,枸櫞酸鉛染色,在JEM-1200EX透射電鏡下觀察肝臟細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的超微結(jié)構(gòu)變化。2.5統(tǒng)計(jì)處理計(jì)量資料mean±SD表示,各組間實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的比較采用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn);等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn),P<0.05為有顯著差異。3結(jié)果3.1動(dòng)物死亡發(fā)生率實(shí)驗(yàn)中模型組較正常組體重增長迅速,且性情較為溫順,不喜動(dòng),各組均無動(dòng)物死亡發(fā)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)模型組動(dòng)物的體重較正常組超重20%以上,其體重、肝指數(shù)(肝濕重/體重×100%)比正常組顯著增高(P分別<0.05和0.01)。詳見表3。3.2血清脂質(zhì)變化實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),模型組血TCH、FFA顯著高于正常組(P<0.05),血TG與正常組相比無顯著差異。詳見表4。3.3血清肝功能的變化實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),模型組血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)校正常組顯著升高,白蛋白及白蛋白/球蛋白比值與正常組相比無顯著差異。詳見表5。3.4肝臟疾病的發(fā)生3.4.1肉眼觀察正常肝臟無異常變化。模型組肝臟體積明顯增大,包膜緊張,邊緣圓鈍,整個(gè)肝臟呈奶黃色,并見局灶性黃白色變性灶,切面油膩。3.4.2肝組織病理學(xué)結(jié)果光鏡下,正常組大鼠肝臟無異常病變。在10周時(shí)隨機(jī)處死模型組大鼠一只,病理學(xué)檢查僅示輕度脂肪肝,而無炎癥、壞死,故繼續(xù)高脂飲食。至12周時(shí),剩余的模型組所有動(dòng)物均出現(xiàn)程度不同的彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性,且100%存在小葉內(nèi)炎癥,80%出現(xiàn)匯管區(qū)炎癥,還有匯管區(qū)變性及點(diǎn)狀壞死或壞死灶,甚至部分壞死灶融合成片,并有2例出現(xiàn)碎屑樣壞死,肝組織炎癥細(xì)胞浸潤以單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主,并有一些中性粒細(xì)胞浸潤,但未見肝纖維化。脂變肝細(xì)胞以中央靜脈周圍最為明顯,極度腫脹呈圓形,體積較正常明顯增加,胞漿內(nèi)充滿大量脂肪空泡,酷似泡沫細(xì)胞,界限不清,肝竇狹窄。詳見表6、表7。3.4.3脂滴、聚積物模型組可見肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)明顯異常。肝細(xì)胞索排列紊亂,胞漿脂滴大量出現(xiàn)且嚴(yán)重聚積,常成群出現(xiàn),大多呈卵圓形或圓形,單個(gè)脂滴直徑達(dá)6μm以上。毛細(xì)膽管排列不整齊,線粒體嵴輕度腫脹,肝星狀細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞明顯增生。4蛋氨酸-堿缺乏模型非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholicsteatohepatitis,NASH)是指病理學(xué)上和酒精性肝炎相類似,即也有:肝細(xì)胞脂肪變性,小葉和匯管區(qū)炎癥,有時(shí)亦可有Mallory小體形成,肝纖維化等,但無飲酒史的病理狀態(tài)。過去認(rèn)為NASH是一種良性可逆性病變,但隨著對其研究的深入,目前普遍認(rèn)為NASH不再是良性病變,它是非酒精性脂肪肝發(fā)展為肝纖維化、肝硬化等嚴(yán)重肝病的一個(gè)重要的必經(jīng)階段。近幾年隨著生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的變化,肥胖癥所致的NASH已成常見病、多發(fā)病。但NASH的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確,在防治上亦缺乏有效手段。因此,積極開展NASH的基礎(chǔ)研究十分必要。而為了闡明其發(fā)病機(jī)制,研究更準(zhǔn)確的診斷方法,篩選有效的防治藥物,除了從臨床對人體直接觀察外,采用動(dòng)物模型開展實(shí)驗(yàn)研究已成為不可缺少的重要環(huán)節(jié)。一個(gè)理想的動(dòng)物模型應(yīng)是:1)與人類疾病特征相似;2)病變有一定發(fā)展過程;3)形成率高,死亡率低,重復(fù)性好;4)造模方法簡便易行。目前國內(nèi)NASH的動(dòng)物模型鮮有報(bào)道,而國外NASH的動(dòng)物模型僅有兩個(gè),且存在明顯缺點(diǎn)。一個(gè)是Weltman等使用的蛋氨酸-膽堿缺乏(MCDD)模型,大鼠食用蛋氨酸-膽堿缺乏飼料后,第4周出現(xiàn)脂肪肝,13周時(shí)肝脂變加重,且伴有炎癥、壞死,中央靜脈周圍纖維化,也就是形成了NASH;另一個(gè)則是YangSQ等使用的內(nèi)毒素模型,即給遺傳性肥胖Zucker大鼠或小鼠注射低劑量(0.5mg/kg體重)的脂多糖,24小時(shí)內(nèi)有21.2%動(dòng)物死亡,存活下來的則產(chǎn)生脂肪性肝炎的表現(xiàn),如灶性壞死,炎癥細(xì)胞浸潤。由于動(dòng)物對膽堿缺乏的敏感性取決于膽堿氧化酶的含量,而人類肝臟不含膽堿氧化酶,因而不存在膽堿缺乏問題,所以前者不僅不符合人類膳食情況,而且與人的自然發(fā)病情況大相徑庭,故不宜用于NASH發(fā)病機(jī)制的研究;后者對動(dòng)物品系有一定要求,且造模動(dòng)物死亡率高,故兩種模型的實(shí)用性均有限。本研究對國內(nèi)外已有能誘發(fā)脂肪肝模型的高脂飼料配方進(jìn)行了改良,加大其中膽固醇及豬油所占比例,12周后模型組大鼠顯著超重,伴有明顯高膽固醇、高游離脂肪酸血癥,血清轉(zhuǎn)氨酶亦顯著升高,肝組織學(xué)示非酒精性脂肪肝的復(fù)制率達(dá)100%,且伴有炎癥、壞死,符合NASH的病理學(xué)表現(xiàn);整個(gè)造模過程中無一例動(dòng)物死亡。模型組大鼠體重超重和肥胖與大量進(jìn)食動(dòng)物性脂肪和膽固醇,導(dǎo)致能量攝入增加有關(guān);而高膽固醇血癥則主要與以下幾點(diǎn)有關(guān):1)高膽固醇飲食,使肝臟膽固醇含量增加,低密度脂蛋白(LDL)受體合成減少;2)飲食中飽和脂肪酸高,可抑制膽固醇酯在肝臟合成,促進(jìn)無活性的非酯化膽固醇轉(zhuǎn)入活性池;促進(jìn)調(diào)節(jié)性氧化類固醇形成;降低細(xì)胞表面LDL受體活性;降低LDL與LDL受體的親和性;3)肥胖使肝輸出含載脂蛋白B的脂蛋白減少,繼而使LDL生成減少;肥胖還使全身膽固醇合成增加,引起肝內(nèi)膽固醇池?cái)U(kuò)大。本動(dòng)物模型制作方法簡便,對實(shí)驗(yàn)人員無毒,動(dòng)物死亡率為0,可以用鼠等小動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn),且該模型與人類肥胖癥合并高脂血癥性脂肪性肝炎極為相似,其特點(diǎn)為1)體重明顯增加;2)血清TCH和FFA升高;3)肝功能轉(zhuǎn)氨酶明顯升高,白蛋白、球蛋白基本正常;4)肝組織學(xué)呈大泡性脂肪變,伴有小葉和匯管區(qū)炎癥,甚至碎屑樣壞死。因此,該模型是研究NASH的發(fā)病機(jī)制和篩選防治方案良好的實(shí)驗(yàn)材料。肥胖、高脂血癥是發(fā)生NASH的一個(gè)常見原因。多項(xiàng)研究表明,NASH患者中,肥胖者的比例高達(dá)69%~100%。長期和大量進(jìn)食高脂肪、高膽固醇飲食,外源性脂肪大量增加,從小腸吸收后進(jìn)入血液的乳糜微粒增加,肝臟攝取自然就增多。當(dāng)肝臟合成甘油三酯的量大于肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)能力時(shí),甘油三酯則在肝內(nèi)沉積形成脂肪肝。本研究采用高脂肪高膽固醇飲食100%地誘發(fā)了大鼠肥胖脂肪高脂血癥性脂肪肝模型也證明了這一觀點(diǎn);而且,在造模10周時(shí),模型組僅出現(xiàn)輕度脂肪肝,此時(shí)我們未采用內(nèi)毒素等任何干預(yù)因素,而只是繼續(xù)高脂、高膽固醇飲食就成功地復(fù)制了肥胖性高脂血癥性脂肪性肝炎的動(dòng)物模型,這也說明了非酒精性脂肪肝不