第五章 原生質(zhì)體培養(yǎng)

第五章原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)的概念和意義植物原生質(zhì)體分離植物原生質(zhì)體培養(yǎng)第一節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)的概念及意義一、概念：原生質(zhì)體的概念原生質(zhì)體培養(yǎng)的概念原生質(zhì)體（Protoplast）1880,Hanstein：質(zhì)壁分離時，能夠與細(xì)胞壁分開的那部分細(xì)胞物質(zhì)。含義：去掉細(xì)胞壁的由質(zhì)膜包裹、具有生活力的裸露細(xì)胞。植物原生質(zhì)體培養(yǎng)的概念

指將植物細(xì)胞游離成原生質(zhì)體，在適宜的培養(yǎng)條件下，依據(jù)細(xì)胞的全能性使其再生細(xì)胞壁，進(jìn)行細(xì)胞的分裂分化，并發(fā)育成完整植株的過程。二、原生質(zhì)體培養(yǎng)發(fā)展簡史及其意義1.發(fā)展簡史1892年：Klercker機(jī)械法(利刃)分離原生質(zhì)體；1960年：英國諾丁漢大學(xué)Cocking教授率先利用真菌纖維素酶，制備了大量具有高度活性可再生的番茄幼根細(xì)胞原生質(zhì)體；1968年：纖維素酶和果膠酶投入市場；1968年：Takebe首先用商品酶進(jìn)行原生質(zhì)體分離：煙草葉肉原生質(zhì)體，兩步法和一步法。1971年：Takebe培養(yǎng)煙草葉肉原生質(zhì)體，首次獲得再生植株。1986年：Spangenberg單個原生質(zhì)體培養(yǎng)成功； 1993年有49個科、146個屬的320多種植物，經(jīng)原生質(zhì)體培養(yǎng)得到了再生植株。其趨勢主要是農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)植物，從一年生擴(kuò)展到多年生，從草本到木本、從高等植物到低等植物，食用菌、藻類、大豆、棉花、油菜、水稻、玉米、柑桔、獼猴桃、桃、蘋果、馬鈴薯、胡蘿卜、黃瓜、楊樹、云杉等；2原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義

植物原生質(zhì)體細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有特殊性，是用途廣泛的實驗系統(tǒng)，其意義如下：單細(xì)胞無性系的建立遺傳轉(zhuǎn)化的良好受體多種基礎(chǔ)研究的實驗體系體細(xì)胞雜種的形成

第二節(jié)植物原生質(zhì)體分離

細(xì)胞壁是植物細(xì)胞的“圍墻”，主要成分為纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)和少量蛋白質(zhì)等。細(xì)胞壁用其相對堅固的結(jié)構(gòu)包圍著其內(nèi)部的原生質(zhì)體，保護(hù)和支撐著植物細(xì)胞。第二節(jié)植物原生質(zhì)體分離一、分離方法機(jī)械法：利刃機(jī)械切割酶解法：果膠酶和纖維素酶處理1.機(jī)械分離法Klercker將材料置于高滲糖溶液中預(yù)處理，使其發(fā)生質(zhì)壁分離，當(dāng)原生質(zhì)體收縮成球狀時，用利刀切割或機(jī)械磨損組織，傷口處可以釋放處完整的原生質(zhì)體。將材料置于高滲糖溶液發(fā)生質(zhì)壁分離利刀切割或機(jī)械磨損從傷口處釋放原生質(zhì)體2.酶解法

原生質(zhì)體的酶解分離法指將材料放入能降解細(xì)胞壁的混合等滲酶液中保溫一定時間，在酶液的作用下，細(xì)胞壁被降解，從而獲得大量有活力的原生質(zhì)體的方法。2.酶解法

自然生長材料的幼嫩葉片無菌實生苗子葉和下胚軸外植體來源的愈傷組織和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物花粉細(xì)胞①材料

應(yīng)選擇生長旺盛的植物體幼嫩部分，其中，葉肉細(xì)胞分離原生質(zhì)體，來源方便，有明顯的葉綠體，便于在融合中鑒定?；蛘呤腔ò攴蛛x原生質(zhì)體，也因其有各種顏色而便于在融合中鑒定。

但禾本科葉肉原生質(zhì)體往往不能分離,因此常采用懸浮細(xì)胞作為分離原生質(zhì)體的材料，最適宜的細(xì)胞是處于對數(shù)生長早期的細(xì)胞。②酶的種類和濃度纖維素酶類果膠酶類蝸牛酶胼胝質(zhì)酶纖維素酶類纖維素酶半纖維素酶崩潰酶果膠酶類果膠酶離析酶

這些酶均是從不同種類的微生物中提取的。酶的作用在原生質(zhì)體分離時，常常將降解纖維素的酶和分解果膠的酶混合使用，利用果膠分解果膠質(zhì)的特性從組織中將細(xì)胞游離出來，再在纖維素酶的繼續(xù)作用下把細(xì)胞壁分解而釋放出原生質(zhì)體。蝸牛酶和胼胝質(zhì)酶主要作用于花粉母細(xì)胞和四分孢子原生質(zhì)體分離，因為花粉母細(xì)胞和四分孢子的細(xì)胞壁中除有纖維素外，還有幾丁質(zhì)和多糖等構(gòu)成的胼胝質(zhì)(?)。酶液的種類濃度組合酶解時間酶解分離原生質(zhì)體的關(guān)鍵③

酶解方法A.材料預(yù)處理(暗處理，預(yù)培養(yǎng)和低溫處理)

在酶處理前，常把供體組織置于合適濃度的穩(wěn)壓液中，使細(xì)胞預(yù)質(zhì)壁分離約一小時后再用酶液處理。

原因：預(yù)質(zhì)壁分離可使胞壁內(nèi)表層充分暴露，增加胞壁降解酶與胞壁的接觸面而提高胞壁降解速度；降低原生質(zhì)體內(nèi)電解質(zhì)滲漏，防止在分離期間外來酶被吸入細(xì)胞內(nèi)，降低原生質(zhì)體對酶液中可能存在的有害影響的敏感，提高原生質(zhì)體的穩(wěn)定性和存活率。B.酶解處理的條件

光照：一般黑暗下靜止進(jìn)行；溫度：25℃～30℃

，兼顧原生質(zhì)體及酶活性；時間：幾小時到幾十小時，太長不利于原生質(zhì)體的活性，一般<24小時。如煙草葉片酶處理2小時后葉肉細(xì)胞解離完畢。C.原生質(zhì)體分離過程：一步法（以煙草葉片為例）第一步：預(yù)處理即對煙草植株限制供水第二步：取幼葉常規(guī)表面消毒后在無菌條件下剝?nèi)ネ獗砥で谐?cm的小塊第三步：加入混合酶液（纖維素酶2%和果膠酶0.5%）并加入的0.7mol甘露醇0.1mmolCaCl2.PH5.6第四步：將小塊煙葉放入混合酶液25℃處理8~10小時第五步：過濾、離心、洗滌（0.7mol甘露醇液含0.1mmolCaCl2

）。如此2~3次、得原生質(zhì)體圖示原生質(zhì)體分離過程（以葉片為例）過濾、離心加果膠酶和纖維素酶二、原生質(zhì)體純化酶解處理后得到混合液包括原生質(zhì)體、細(xì)胞團(tuán)和組織碎片等，必須將雜質(zhì)和酶液除去，才可以繼續(xù)培養(yǎng)。清除這些雜質(zhì)的過程稱為原生質(zhì)體純化。原生質(zhì)體純化方法有：沉降法、漂浮法和不連續(xù)梯度離心法三種1、沉降法原理：應(yīng)用原生質(zhì)體的比重大于溶液，離心后原生質(zhì)體沉于底部。步驟：第一步原生質(zhì)體溶液用400目網(wǎng)篩過濾。第二步離心（500~1000r/min離心5~6min）。第三步吸取上清液，用洗滌液（含甘露醇）重新懸浮，再離心沉淀。如此2~3次。第四步用原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗1次，收集原生質(zhì)體。洗滌液成分：0.45mol/L甘露醇，

10mmol/LCaCl2`H2O,0.7mmolKH2PO4,洗滌液pH：5.62、漂浮法原理：采用比原生質(zhì)體密度大的高滲溶液，使原生質(zhì)體漂浮在液體的表面。洗滌液：3%蔗糖+0.4mol/L甘露醇+1480mg/LCaCl22H2O。或11%~23%的蔗糖溶液。在游離和純化原生質(zhì)體過程中始終用分子量和浮力較大的蔗糖作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，原生質(zhì)從分離到洗滌純化全部漂浮在溶液表層。此法對離心力要求比較嚴(yán)格，有可能原生質(zhì)體不漂浮。

3.不連續(xù)梯度離心法以柑桔為例25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液原理：選兩種不同密度的溶液，其中一種溶液的密度大于原生質(zhì)體的密度，另一種溶液的密度小于原生質(zhì)體的密度，原生質(zhì)體介于兩種溶液之間。原生質(zhì)體

原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的首要條件是獲得大量、完整、有活力的原生質(zhì)體。三、原生質(zhì)體活力測定形態(tài)識別相差顯微鏡法酚藏花紅染色法伊凡藍(lán)染色法FDA測原生質(zhì)體活力的原理四、影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素1.供試材料2.酶的種類、組合和酶解時間3.滲透壓穩(wěn)定劑4.質(zhì)膜穩(wěn)定劑5.PH6.光照和溫度1.供試材料雖然已能從各種植物組織和細(xì)胞中獲得完整的原生質(zhì)體，但植物種類、所選材料的生理和發(fā)育狀態(tài)、供試材料的生長條件等因素均對分離出的原生質(zhì)體數(shù)量和活力有很大影響。下列材料是較理想的分離原生質(zhì)體的供試材料。①

自然生長的幼嫩葉片這類材料取材方便，來源廣泛，在適宜處理條件下，可以獲得大量活性較高的原生質(zhì)體。②

無菌實生苗子葉和下胚軸種子易于滅菌，可以在短期內(nèi)獲得大量的供試無菌苗。子葉和下胚軸細(xì)胞年幼，具有較強(qiáng)的分裂和成苗能力，能產(chǎn)生較多的具高分生能力的原生質(zhì)體。③

外植體來源的愈傷組織和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物這些材料不