hplc法測定蜘蛛香藥材中草素、乙酰草素及其分解產物baldlinal

hplc法測定蜘蛛香藥材中草素、乙酰草素及其分解產物baldlinal

蜘蛛香是科草科的一種蝴蝶香。該屬植物藥理作用廣泛,作為溫和的鎮(zhèn)靜劑使用由來已久。蜘蛛香中鎮(zhèn)靜安神、抗抑郁等作用的主要活性成分為纈草素類,其纈草素、乙酰纈草素的量較同屬植物為高,且二者分解產物baldrinal能更大地降低小鼠自主活動。蜘蛛香為《中國藥典》1977年版一部收載品種,但對蜘蛛香藥材并未作定量測定要求。本實驗選擇蜘蛛香中量較高且藥理活性明確的3種有效成分(纈草素、乙酰纈草素、baldrinal)作為定量指標,采用HPLC的外標法,測定了不同采集地和采集時間的多批蜘蛛香藥材中上述3種成分的量,揭示了蜘蛛香藥材中3種成分的變化規(guī)律,為蜘蛛香的質量控制和合理利用提供了依據(jù)。1儀器、設備和濾過方式高效液相色譜儀:Agilent1100型高效液相色譜儀(德國AgilentTechnologies)。配二極管陣列檢測器和ChemStation色譜工作站,四元溶劑系統(tǒng)、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱。KQ5200E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。HPLC級乙腈(美國Fisher公司)。純凈水(杭州娃哈哈集團,經0.45μm水系濾膜濾過)。對照品纈草素、乙酰纈草素、baldrinal(自制,HPLC檢測質量分數(shù)>98%)。各批蜘蛛香藥材(經北京中醫(yī)藥大學石晉麗副教授鑒定)。其他試劑均為分析純。2方法和結果2.1流動相、柱溫度色譜柱:LunaC18柱(250mm×4.6mm,5μm;美國Phenomenex公司);流動相:乙腈-水(60∶40);檢測波長為256nm;體積流量為0.95mL/min;柱溫為40℃。在此色譜條件下3種待測化合物的混合對照品溶液(A)和蜘蛛香藥材(B)的色譜分離結果見圖1?？梢?蜘蛛香中3種化合物得到了基線分離。2.2線性范圍與檢出限分別精密稱取纈草素、乙酰纈草素、baldrinal各3mg,置15mL量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻制成混合對照品溶液。依次精密吸取混合對照品溶液7個進樣體積進行HPLC分析,在上述色譜條件下檢測峰面積,同一進樣體積連續(xù)測3次,3種成分均以進樣體積為橫坐標(X),以平均峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸,計算回歸方程,纈草素、乙酰纈草素、baldrinal線性方程分別為Y=350.5X+68.026,r=0.9999,線性范圍為0.2~9μg;Y=410.9X+9.1536,r=0.9999,線性范圍為0.2~9μg;Y=126.69X+7.9517,r=0.9997,線性范圍為0.2~7μg。2.3超聲提取法蜘蛛香藥材粉碎(60目篩),精密稱取1.0g,加甲醇50mL,浸泡0.5h,超聲提取40min,甲醇補足損失質量,取上清液經0.45μm膜濾過,即得。2.4baldrenal質量分數(shù)的rsd值精密吸取混合對照品溶液5μL,重復進樣5次,記錄峰面積,測得纈草素、乙酰纈草素、baldrinal質量分數(shù)的RSD值分別為0.32%、0.12%、0.24%。2.5制備品質量分數(shù)的rsd分別稱取同批蜘蛛香藥材粉末(60目)5份,按供試品操作方法平行制備,進樣5μL,連續(xù)測3次,測得3者質量分數(shù)的RSD值分別為1.28%、1.78%、1.36%。2.6穩(wěn)定性試驗2.6.1rsd值的測定精密吸取混合對照品溶液5μL,于配制后0、4、8、12、24、36、48h測定峰面積,計算RSD值分別為0.23%、0.76%、0.63%。2.6.2rsd值的測定精密吸取供試品溶液(按2.3項下制備)5μL,于配制后0、4、8、12、24、36、48h測定峰面積,計算RSD值分別為0.70%、1.43%、1.08%。2.7供試品溶液的制備以河北省藥材公司所提供蜘蛛香藥材為研究對象,精密稱定已測定質量分數(shù)的藥材粗粉5份,每份1.0g,分別加纈草素7.0mg,乙酰纈草素0.95mg,baldrinal0.40mg,按供試品溶液制備,測定。3者平均回收率分別為100.1%、99.9%、102.1%,RSD分別為0.98%、1.06%、1.78%。2.8標準曲線上測定總標準曲線下的質量分數(shù)精密稱取不同來源的15份蜘蛛香藥材粉末1.0g(60目),精密加50mL甲醇,按上述供試品溶液制備,以25μL進樣,測定色譜峰峰面積,根據(jù)標準曲線計算質量分數(shù),結果見表1。3測定指標成分為為檢測對象,確定其含量測定的方法學考察。對于對于測定犯3.1為了在短時間內獲得好的分離效果,對色譜條件進行了優(yōu)化:首先對3種不同的色譜柱MerckLichroCART125-4withLichrospher100-8、PhenomenexLunaC18和NucleosilC18柱進行了考察,其中以PhenomenexLunaC18柱對蜘蛛香中環(huán)烯醚萜類成分分離效果好,柱效高,故選用該柱進行測定。其次考察了不同流動相(甲醇-水、乙腈-水)系統(tǒng),加酸(冰醋酸、磷酸)后對蜘蛛香中環(huán)烯醚萜類成分的分離效果,結果顯示甲醇-水系統(tǒng)分離效果不及乙腈-水系統(tǒng),雖然加入0.3%磷酸可略提高分離效果,但酸液會對色譜柱造成損害,綜合考慮各因素,確定采用乙腈-水(60∶40)為流動相系統(tǒng)進行洗脫。此外還考察了不同體積流量(0.90、0.95、1.00mL/min)、不同柱溫(30、35、40℃)對蜘蛛香中環(huán)烯醚萜類成分的分離效果,確定最佳流量為0.95mL/min,柱溫為40℃。通過紫外進行全波長掃描,3個被測化合物最大吸收波長均在256nm附近,故檢測波長設在256nm。在上述條件下,能夠在30min之內測定蜘蛛香中的3個主要成分。此方法簡便、快速、可靠,適用于蜘蛛香藥材的質量控制。3.2纈草素、乙酰纈草素是雙烯型纈草三酯,該類成分不穩(wěn)定,不耐熱,在酸水(乙醇)或堿水(乙醇)中會很快降解成黃色的baldrinal。但將該類成分溶解在純甲醇中,置冰箱中冷凍保存,則穩(wěn)定性良好。從而使外標法測定纈草素、乙酰纈草素成為可能,因而選用甲醇作為提取溶劑。3.3中藥材所含化學成分復雜多樣,很難以單一成分作為標準來評價藥材質量。本實驗選擇纈草素、乙酰纈草素、baldrinal作為指標成分原因如下:崔亞君等曾對7種川產纈草屬植物中的纈草素和乙酰纈草素進行了定量檢測,7種植物中均含有纈草素,以蜘蛛香中為最高;除蜘蛛香外,其余植物均未檢測到乙酰纈草素;纈草素和乙酰纈草素的分解產物為baldrinal對小鼠自主活動的影響遠大于二者,在德國,這種分解產物被定為纈草的標示成分之一。故筆者從質量分數(shù)、專屬性和藥理活性三方面綜合考慮,確定3者為蜘蛛香藥材的指標成分。3.4蜘蛛香藥材一般都為野生,少有栽培,主產于我國云南、四川、貴州等地。定量測定結果表明,不同產地和收集地的3成分量有較大差異,纈草素的量以云南師宗縣