蜘蛛香總黃酮對h22小鼠抗腫瘤作用及對cancil的影響

蜘蛛香總黃酮對h22小鼠抗腫瘤作用及對cancil的影響

肝癌是世界上最常見的腫瘤之一，其惡性程度高，發(fā)展迅速，預后差，嚴重威脅著人們的健康和生活。蜘蛛香總黃酮系敗醬科(Valerianaceae)纈草屬(ValerianaLinn.)植物蜘蛛香(ValerianajatamansiJones)的根莖和根,課題組前期研究發(fā)現(xiàn),蜘蛛香總黃酮提取物對體外培養(yǎng)的人結腸癌細胞具有明顯的抑制增殖和抗轉移作用。本研究通過建立荷H22小鼠模型,進一步考察了其體內抗肝癌作用,應用小鼠全基因組基因芯片對pathwaysincancer的變化進行了考察,從而在信號通路水平研究其抗腫瘤作用機制。1材料表面1.1動物1.2腫瘤植株小鼠肝癌H22瘤株,由四川大學華西醫(yī)學中心免疫實驗室提供。2方法2.1動物模型的制備2.2dna的純化、純化及分析。式中,C為模型組平均瘤重(g),T為給藥組平均瘤重(g)。②基因表達譜芯片檢測:股動脈取血后處死小鼠,解剖取出腫瘤,迅速放入液氮罐凍存。采用Trizol(Invitrogen公司)一步法提取小鼠腫瘤的總RNA,RNeasyminikit(Qiagen公司)純化RNA,用瓊脂糖凝膠電泳對樣品總RNA進行定量、質檢。實驗標記方法采用Agilent放大標記方法,各取適量探針進行雜交,雜交方法采用65℃,17h滾動雜交,并在室溫洗片。芯片結果采用Agilent掃描儀進行掃描(Scanresolution:5μm;PMT:100%,10%),AgilentFeatureExtraction軟件讀取數(shù)據(jù)。最后采用FeatureExtraction進行Normalize處理分析。通過AgilentGeneSpringGXsoftware軟件處理得到基因表達變化的倍數(shù)。差異表達基因篩選標準為比值>2為表達上調基因,比值<0.5為表達下調基因(數(shù)據(jù)小于0.5時取倒數(shù))。通過KEGG信號通路數(shù)據(jù)庫,查詢各用藥組與模型對照組相比表達差異基因所參與的pathwaysincancer變化情況。3結果3.1肝癌抑制作用3.2各組遺傳因素的差異3.3各組遺傳因素的差異3.4遺傳因素的差異是對遺傳因素的分析4tfr、igf1和pi3k-akt1的結構及表達我們在前期體內抗H22活性的基礎上,運用基因表達譜芯片技術對蜘蛛香總黃酮抑制小鼠H22的差異表達基因進行初步篩選,以期從基因水平闡釋出蜘蛛香總黃酮抗H22肝癌的機制。通過對差異表達基因的分析,發(fā)現(xiàn)下調的基因在pathwaysincancer通路中都起到對腫瘤促進作用,參與血管生成、抑制腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤細胞增殖和遷移等多個方面。研究發(fā)現(xiàn)Epas1、Pdgfra均能通過誘導Vegf的表達促進血管的生成,下調Epas1、Pdgfra、Vegfc、Figf能抑制血管生成,從而阻止腫瘤細胞的生長和轉移。Csf1r的過量表達與肝癌細胞的生長、分化及轉化密切相關,可能是c-fms原癌基因發(fā)生點突變導致Csf1r表達量增加,后者通過自分泌生長方式促進肝癌細胞的生長和轉化。同時,Pdgfra、Vegfc、Figf、Csf1r、Igf1又能通過PI3K-AKT途徑促進腫瘤生成、侵襲和轉移。Pik3r1是一類特異的催化磷脂酰肌醇脂物質的激酶,由其活化而產(chǎn)生的類脂產(chǎn)物PIP2和PIP3作為第二信使結合并激活多種細胞內靶蛋白,形成一個信號級聯(lián)復合物,最終調節(jié)細胞的增殖、分化、存活和遷移,通過下調Pdgfra、Vegfc、Figf、Csf1r、Igf1、Pik3r1、Prkcb而抑制了PI3K-AKT途徑。Fzd9Frizzle基因家族的成員編碼了一個7次跨細胞膜的跨膜蛋白,這個蛋白是Wnt信號通路的組成成員,并在其中發(fā)揮了重要的作用。Wnt途徑的異?；罨诩毎┳?、腫瘤發(fā)生及腫瘤侵襲過程中具有重要的作用。當基因本身或通路其他任一成員因素發(fā)生變化使其不正?；罨瘯r,均有可能引起腫瘤,其中FZD受體的異常表達可見于多種惡性腫瘤。Tcf7l1、Tcf7l2、Fzd9、Prkcb參與Wnt信號傳導通路,與腫瘤細胞增殖和分化相關。下調這些基因,能從Wnt途徑對腫瘤起到抑制作用。CyclinE是細胞周期蛋白中的一種,它可與CDk2結合形成復合物,磷酸化其底物,釋放轉錄因了E2F,啟動DNA復制,使細胞由G1期進入S期,是G1/S期轉換的主要限速因子,P15(CDKN2B)在TGFβ介導的生長抑制中起重要作用。TGFβ誘導細胞阻滯在G1期,起源于P15轉錄量的增加,后者可與cyclinD/cdk4、cyclinD/cdk6復合體結合,取代復合體中的P27,使P27結合并抑制cyclinE/cdk2復合體。TGFβ抑制生長的作用歸因與上述兩種cyclin/cdk復合體的共同抑制。Myc基因是人類腫瘤中最常見的高表達的癌基因之一,它在肝癌中呈高表達,涉及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中許多方面,如細胞增殖、分化、凋亡等。各種模式證實,c-myc的過度表達能導致細胞增殖和細胞死亡都增加,從而使腫瘤的絕對細胞數(shù)沒有凈增加。同時,我們發(fā)現(xiàn)Ctbp2、Mmp1a、Vegfa出現(xiàn)了上調,這3個基因分別涉及促進上皮-間質轉化、降解多種細胞外基質和基底膜成分和促血管生成,這說明蜘蛛香總黃酮抑制腫瘤作用的復雜性有待于我們的下一步深入探討?？傊?蜘蛛香總黃酮可以通過下調多種功能基因從腫瘤細胞凋亡、增殖和遷移等多個方面發(fā)揮抗腫瘤作用。其抗腫瘤作用是多個靶基因共同作用的結果,尚需使用功能分類基因芯片對表達譜芯片進行進一步研究。昆明種小鼠,體重18~22g,雌雄各半,由成都達碩生物科技有限公司提供,合格證號:SCXK(川)2008-24。1.3齊魯制藥有限公司蜘蛛香,購于成都市荷花池藥材市場;替加氟,齊魯制藥有限公司,批號910006LD;羧甲基纖維素鈉(CMC-Na),成都市科龍化工試劑廠,批號20090929。1.4儀器與檢測方法Agilent小鼠全基因4*44K芯片,美國Roche-Nimblegen公司;PTC-100PCR儀,美國MJ公司;G2545A雜交爐,美國Agilent公司;G2565BA掃描儀,美國Agilent公司;ND1000分光光度計,美國Nanodrop公司。無菌操作條件下取荷肝癌H22小鼠腹水,生理鹽水稀釋至腫瘤細胞濃度為1×107·mL-1,于每只小鼠左腋皮下接種0.2mL。蜘蛛香總黃酮:采用超聲提取法從蜘蛛香干燥粉末中提取,并用HPD600大孔樹脂進行純化,得到的總黃酮質量分數(shù)為41.20%。將上述制得的蜘蛛香總黃酮用0.5%CMC-Na分別配成高、低兩個劑量,密封,置4℃冰箱中冷藏備用。替加氟溶液:用0.5%CMC-Na將替加氟片配成濃度10mg·mL-1的溶液,密封,置4℃冰箱中冷藏備用。2.3mt-na的制備接種第二天,將小鼠稱重并隨機分為4組,每組10只,雌雄各半。模型對照組:灌胃0.5%CMC-Na,20mL·kg-1;陽性對照組:灌胃替加氟溶液,200mg·kg-1;蜘蛛香總黃酮高、低劑量組:灌胃蜘蛛香總黃酮提取物溶液,劑量分別為生藥450mg·kg-1、150mg·kg-1。每日按0.2mL·10g-1標準定時灌胃給藥1次,連續(xù)給藥10d。2.4兩組患者施工前后ph、nb、csf1和vegf1的基因表達比較①瘤重和抑瘤率:給藥結束次日,將動物股動脈取血后處死,小心剝離出皮下腫瘤塊并稱重,按下式計算出腫瘤抑制百分率。陽性對照組、蜘蛛香總黃酮高、低劑量組的平均瘤重明顯降低,與模型對照組相比具有統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.05),各組的抑瘤率分別為45.32%、30.06%、25.97%,見表1。運用KEGG信號通路數(shù)據(jù)庫,查詢各用藥組與模型對照組相比表達差異基因所參與的pathwaysincancer變化情況,發(fā)現(xiàn)陽性對照組、蜘蛛香總黃酮高劑量組和低劑量組與模型對照組相比,pathwaysincancer中17個基因的表達同時發(fā)生了顯著性變化,其中6個明顯上調,11個明顯下調,見表2。相對于模型對照組,陽性對照組、