第5章1 生物化學在環(huán)境科學中的應(yīng)用

環(huán)境生物化學主講教師：崔明超電話公地點：工程南樓403Email：cuimingchao@第五章現(xiàn)代環(huán)境生物技術(shù)原理——5.1現(xiàn)代生物技術(shù)概述5.1.1現(xiàn)代生物技術(shù)定義以現(xiàn)代生命科學為基礎(chǔ)，結(jié)合先進的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)學科的科學原理，按照預先的設(shè)計改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達到某種目的5.1.2現(xiàn)代生物技術(shù)及應(yīng)用廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、化工、食品、環(huán)境保護等眾多領(lǐng)域核心技術(shù)5.1.3現(xiàn)代環(huán)境生物技術(shù)美國密歇根州立大學的J.M.Tiedje教授認為，環(huán)境生物技術(shù)的核心是微生物學過程指的是直接或間接利用生物或生物體的某些組成部分或某些機能，建立降低或消除污染物產(chǎn)生的生產(chǎn)工藝，或者能夠高效凈化環(huán)境污染，同時又生產(chǎn)有用物質(zhì)的工程技術(shù)高、中、低三個層次以基因工程為主導傳統(tǒng)的生物處理技術(shù)利用天然處理系統(tǒng)目前環(huán)境生物技術(shù)面臨的任務(wù)有：解決基因工程菌從實驗室進入模擬系統(tǒng)和現(xiàn)場應(yīng)用過程中，其遺傳穩(wěn)定性、功能高效性和生態(tài)安全性等方面的問題開發(fā)廢物資源化和能源化技術(shù)建立無害化生物技術(shù)清潔生產(chǎn)新工藝發(fā)展對環(huán)境污染物的生理毒性及其對生態(tài)影響的檢測技術(shù)——5.2酶工程基本原理酶工程是指利用生物有機體內(nèi)酶所具有的某些特異催化功能，借助固定化生物反應(yīng)器和生物傳感器等新技術(shù)、新裝置，高效優(yōu)質(zhì)地生產(chǎn)特定產(chǎn)品的一種新技術(shù)內(nèi)容包括：對生活在極端環(huán)境條件下的嗜熱菌、嗜冷菌、嗜鹽菌、嗜堿菌、嗜壓菌等微生物的研究受到人們的重視，試圖從中找出具有特殊功能的酶在開發(fā)酶的新用途方面，最引人注目的是清潔生產(chǎn)工藝的運用，使污染最小化酶的生產(chǎn)與分離純化酶分子修飾酶固定化酶反應(yīng)動力學在環(huán)境污染治理、工業(yè)、醫(yī)藥、衛(wèi)生和理論探索等方面的應(yīng)用5.2.1酶固定化概念又稱水不溶性酶，是通過物理吸附法和化學鍵合法將水溶性酶合固態(tài)的不溶性載體相結(jié)合，使酶變成不溶于水但仍保留催化活性的衍生物特點：穩(wěn)定性強：載體有效保護酶的天然構(gòu)型，不受酸堿有機溶劑等影響適合于連續(xù)化、自動化和管道化工藝，還可回收、再生合重復使用固定化酶可以設(shè)計成不同形式：如酶片、酶布、酶柱非水溶劑中的酶促反應(yīng)水與酶分子的相互作用水是極性分子，可促進離子鍵和極性共價鍵化合物的解離；形成氫鍵時可作為質(zhì)子的受體和供體酶分子與水相互作用，對于穩(wěn)定酶分子復雜的立體結(jié)構(gòu)和保持酶的催化活性具有重要意義；但水也參與多數(shù)引起變性的反應(yīng)非水溶劑中的酶促反應(yīng)酶在有機溶劑中保持催化活性的基本條件酶分子的周圍必須存在一個水化層，其需水數(shù)量取決于酶的分子大小、形狀、表面電荷、疏水及親水性質(zhì)等與酶緊密結(jié)合（主要是氫鍵）的“結(jié)合水”，對酶構(gòu)象的形成和維持等起著關(guān)鍵的作用與酶松散結(jié)合起溶劑作用的“大量水”，可部分被有機溶劑取代一般來說，極性有機溶劑可以奪取酶水化層的大部分水，甚至結(jié)合水；而非極性溶劑奪取水的能力較弱非水溶劑中的酶促反應(yīng)有機溶劑中酶促反應(yīng)的特性微環(huán)境的變化由于水的存在而增強，酶的構(gòu)象更具“剛性”適當條件下，改變平衡向有利于合成方向進行在有機溶劑中酶的穩(wěn)定性得到顯著提高大大降低了許多需要水參與的副反應(yīng)可以省略產(chǎn)物的萃取分離過程，提高回收率脂溶性底物和產(chǎn)物在有機溶劑中的高度溶解性，有利于提高底物濃度總水平不存在微生物污染問題是一個非均相反應(yīng)體系，應(yīng)用振蕩或攪拌改善底物及產(chǎn)物的交換是反應(yīng)的關(guān)鍵固定化技術(shù)的研究階段第一階段：載體的開發(fā)第二階段：輔酶系或ATP系和其再生系的建立疏水體系或含水率低的體系中固定化酶的催化反應(yīng)研究添加防止固定化過程中酶活力下降的輔助物的研究固定化活細胞的研究生物固定化技術(shù)的發(fā)展背景生物固定化技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域食品與發(fā)酵工業(yè)：高果糖漿的生產(chǎn)酒精和啤酒的生產(chǎn)氨基酸和有機酸的生產(chǎn)乳品工業(yè)醫(yī)藥工業(yè)廢水生物處理能源開發(fā)生物傳感器基礎(chǔ)理論研究生物固定化技術(shù)的機理帶電荷酶或細胞和帶電荷的載體之間的靜電相互作用細胞表面的氨基（-NH2）和羧基（-COOH）與載體表面上的反應(yīng)基團之間形成離子鍵細胞表面的氨基或羧基和載體表面上的羥基等形成共價鍵包埋載體的孔徑比生物催化劑更小，因而將生物催化劑保留在載體內(nèi)，同時，底物可以進去，反應(yīng)產(chǎn)物可以出來細胞表面的基團和載體上經(jīng)化學修飾而特意接枝上去的集團之間形成共價鍵生物固定化的載體理想的固定化載體應(yīng)具有對生物催化劑無毒、傳質(zhì)性能好、性質(zhì)穩(wěn)定、壽命長、價格低廉等特點目前常用的載體大致可分為有機載體、無機載體和復合載體三大類有機載體如瓊脂、海藻酸鈉（CA）、聚乙烯醇（PVA）、聚丙烯酰胺等，它們在形成凝膠時可將細胞包埋在凝膠內(nèi)部從而達到固定細胞的目的，在廢水處理中得到較多的研究和應(yīng)用無機載體如活性炭、多孔陶珠、紅磚碎粒等，利用其多孔結(jié)構(gòu)對細胞的吸附作用和電荷效應(yīng)固定細胞。相對于有機載體材料來說，無機載體材料大多具有成本低、壽命長,機械強度大和耐酸堿等特性而更具實用性。對于這方面目前研究尚不夠充分有機載體與無機載體組成復合載體，結(jié)合了它們各自的優(yōu)點，改進了材料的性能固定化酶的制備酶的催化活性依賴于酶的空間結(jié)構(gòu)及活性中心。所以固定化時要選擇適當?shù)臈l件，力圖不使其活性中心的基團受到影響。操作時應(yīng)盡量在溫和條件下進行，以盡量保持酶蛋白天然的高級結(jié)構(gòu)酶固定化的方法載體結(jié)合法：以共價結(jié)合、離子結(jié)合和物理吸附等固定在非水溶性載體上：如葡聚糖、活性炭、膠原、瓊脂糖、多孔玻璃珠、高嶺土、硅膠、氧化鋁、羧甲基纖維素等交聯(lián)法：與兩個或兩個以上官能團的試劑反應(yīng)形成共價鍵：如戊二醛、雙重氮聯(lián)苯胺和六甲撐二異氰酸酯包埋法：包埋在凝膠微小格子中，或包裹在半透性的聚合物膜內(nèi)：如聚丙烯酰胺凝膠、聚乙稀醇、瓊脂、硅膠等；尼龍、乙基纖維素和硝酸纖維素逆膠束酶反應(yīng)系統(tǒng)：表面活性劑的兩性分子在有機溶劑中自發(fā)形成聚集體，其親水性一端連接成逆膠束的極性核，水分子插入核中，疏水性一端進入主體有機溶劑中，酶分子溶于逆膠束中固定化酶的性質(zhì)底物特異性的改變：立體障礙使高分子底物與酶分子表面的鄰近效應(yīng)受到干擾最適pH的改變：最適pH的平行移動最適溫度的變化：多數(shù)不發(fā)生變化動力學常數(shù)的變化：Km及Vm的變化穩(wěn)定性變化：普遍增加當酶分子被結(jié)合到帶負電載體上時，酶蛋白的陽離子數(shù)增多，從而造成固定化酶反應(yīng)區(qū)域的pH比外部溶液的pH值偏酸，造成酶的反應(yīng)是在比反應(yīng)液的pH偏酸一側(cè)進行，從而使最適pH值轉(zhuǎn)移到堿性固定化對酶反應(yīng)系統(tǒng)的影響酶構(gòu)象改變：酶分子發(fā)生某種扭曲立體障礙：載體存在造成某種空間障礙微擾效應(yīng)：分配效應(yīng)：底物及各種效應(yīng)物在載體內(nèi)外側(cè)濃度的不等分配擴散限制：與物質(zhì)的分子量大小、載體的結(jié)構(gòu)及酶反應(yīng)性質(zhì)有關(guān)由于底物的疏水、親水及荷電性質(zhì)，使得緊鄰固定化酶的微環(huán)境區(qū)域發(fā)生變化，對酶產(chǎn)生微擾效應(yīng)外擴散限制指底物、產(chǎn)物和其他效應(yīng)物在宏觀體系與酶顆粒表面間的擴散受到了限制，主要存在于酶顆粒周圍的處于層流狀態(tài)的液膜層內(nèi)擴散限制指在多孔性固定化載體內(nèi)，底物、產(chǎn)物和其他效應(yīng)物在載體顆粒表面與載體內(nèi)的酶活性部位間的擴散受到限制5.2.3酶在污染治理中的應(yīng)用含酚廢水處理造紙廢水處理含氰廢水處理食品加工廢水處理含有殘留有機氯農(nóng)藥土壤的處理微生物酯酶的應(yīng)用酯酶具有在液相和有機相界面間起催化作用的獨特性能某些細菌中含有一種特殊的甲烷單加氧酶（MMO），具有比較廣泛的底物選擇性，能夠催化降解大多數(shù)氯代烴污染物——先轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的醇，再在其它酶作用下分解成無害物質(zhì)——5.3基因工程基本原理5.3.1基因工程概述基因工程的誕生：1973年Cohen理論上的三大發(fā)現(xiàn)技術(shù)理論上的三大發(fā)明1934年，DNA是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)——遺傳信息的來源1953年，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)學說——遺傳信息傳遞的方式1961年操縱子學說；1972年中心法則——遺傳信息的流向與表達1970年和1972年限制性核酸內(nèi)切酶和1970年DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)1964年發(fā)現(xiàn)細菌的F-性因子，1973年首次將質(zhì)粒用作載體1970年發(fā)現(xiàn)的逆轉(zhuǎn)錄酶，使真核基因的制備成為可能基因工程的定義：是利用重組DNA技術(shù)，在體外通過人工剪切和拼接等方法，對生物的基因進行改造和重新組合，然后導入受體細胞進行無性繁殖，使重組的基因在受體細胞中表達，產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物用于大規(guī)模生產(chǎn)生物分子改造現(xiàn)有物種及設(shè)計構(gòu)建新物種尋找、分離和鑒定生物體的遺傳信息資源基因工程的主要內(nèi)容核心是DNA重組技術(shù)：獲取目的基因并進行必要的改造選擇合適的載體并加以適當?shù)男揎棇⒛康幕蚺c載體連接，獲得含有目的基因的重組載體將重組載體導入宿主細胞并篩選楚含重組DNA的細胞進行增殖5.3.2目的基因的獲得從基因組DNA中分離基因的化學合成法通過RNA合成cDNA用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法擴增目的基因片段基因文庫與cDNA文庫的構(gòu)建基因的隨機斷裂方法限制性內(nèi)切酶降解基因的核苷酸序列已知從3‘末端開始目前獲得已知基因的主要方法聚合酶鏈反應(yīng)，不需要借助于分子克隆，可以在體外快速繁殖和擴增DNA的技術(shù)原理：應(yīng)用與待擴增的目的DNA片段兩側(cè)互補的引物，在DNA聚合酶的作用下，引發(fā)目的DNA片段反復復制，從而使目的DNA片段拷貝迅速增加的過程變性→退火→延伸DNA分子數(shù)目呈2的指數(shù)增加從耐熱菌中純化得到一種特殊的TaqDNA聚合酶，可在較高溫度下催化聚合局限性：TaqDNA聚合酶缺乏校正功能，產(chǎn)生較高的錯誤摻入率指含有某種生物體全部基因片段的重組DNA克隆群體5.3.3基因工程載體指可以攜帶目的基因進入宿主細胞的運載工具具有自主復制能力，能帶動外源基因在宿主細胞內(nèi)復制和擴增具有較多的拷貝數(shù)，易于分離提純分子質(zhì)量相對較小，便于操作，并有足夠的接納目的基因的容量有供外源基因插入的多個單一限制性核酸內(nèi)切酶位點，用于目的基因的克隆有一個或多個篩選標記常用基因工程載體質(zhì)粒載體改造過的人工質(zhì)粒，常用的有pBR322、pUC、pGEM等λ噬菌體載體DNA長48kb，插入型和取代型兩種黏性質(zhì)粒與人工染色體pBR3224363kb四環(huán)素抗藥性基因標記由質(zhì)粒和λ噬菌體的cos黏性末端構(gòu)建而成，主要用于真核細胞基因組文庫的構(gòu)建5.3.4基因工程工具酶限制性核酸內(nèi)切酶：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型DNA聚合酶：大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ、Klenow聚合酶、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶DNA連接酶：T4DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶其他DNA修飾酶5.3.5重組體的構(gòu)建相同酶切位點的連接不同限制酶產(chǎn)生相同黏性末端的連接平末端連接：T4DNA連接酶，效率低同聚物加尾連接人工接頭連接5.3.6重組體DNA導入受體細胞重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化重組噬菌體的感染真核細胞的基因轉(zhuǎn)染受體細胞的條件：DNA限制性內(nèi)切酶缺陷型，使之不能隨便切割、破壞重組載體DNA分子不適于人體內(nèi)和非培養(yǎng)條件下生存5.3.7重組體的篩選根據(jù)重組體的遺傳表型篩選抗生素篩選營養(yǎng)缺陷型互補篩選根據(jù)重組體結(jié)構(gòu)特征的篩選快速裂解菌落比較重組DNA的大小限制性內(nèi)切酶酶切鑒定雜交分析PCR篩選5.3.8外源基因在宿主中的表達外源基因必須在調(diào)節(jié)元件控制下進行轉(zhuǎn)錄和表達外源基因在原核細胞中的表達宿主遺傳背景清楚，培養(yǎng)簡單，迅速適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)缺乏適當?shù)姆g后加工機制，后續(xù)純化困難外源基因在真核細胞中的表達研究該基因在細胞中的作用和機制；獲得足夠量的純化目的蛋白5.3.9基因工程在環(huán)境污染治理中的應(yīng)用基因工程為改變細胞內(nèi)的關(guān)鍵酶或酶系統(tǒng)提供了可能設(shè)計復合代謝途徑，提高微生物的降解速率拓寬氧化酶的專一性維持低濃度下的代謝活性改善有機污染物降解過程中的生物催化穩(wěn)定性等——5.4微生物細胞工程是運用精巧的細胞學技術(shù)，有計劃地改造細胞遺傳結(jié)構(gòu)，從而培育出人們所需要的生物品種或具有某些新性狀的細胞群體細菌、放線菌等原核細胞，生長迅速，DNA裸露于細胞質(zhì)中，不與蛋白質(zhì)結(jié)合，易于遺傳操作，是細胞改造的良好材料；而其胞外由肽聚糖組成的細胞壁是細胞融合的主要障礙基本操作：無菌操作技術(shù)、細胞培養(yǎng)技術(shù)、細胞融合技術(shù)細胞培養(yǎng)將細胞從生物體內(nèi)取出，在特制的培養(yǎng)容器內(nèi)給予必要的生長條件，使其在體外繼續(xù)生長與繁殖關(guān)鍵因素：營養(yǎng)和生長環(huán)境動物細胞培養(yǎng)，植物的花粉、原生質(zhì)體的培養(yǎng)等細胞融合在一定條件下，將兩個或多個細胞融合為一個細胞的過程，又稱細胞雜交細胞融合已經(jīng)成為遺傳轉(zhuǎn)化與研究的最有效手段之一促融因子作用下，細胞凝集，質(zhì)膜發(fā)生粘連，細胞質(zhì)開始融合，繼續(xù)培養(yǎng)過程中，發(fā)生核融合，形成雜種細胞動物和植物細胞之間也可以雜交細胞重組在體外條件下，運用試驗技術(shù)從活細胞中分離出各種細胞的結(jié)構(gòu)或組件，再根據(jù)需要把它們在不同的細胞之間重新進行裝配，成為具有生物活性的細胞核移植主要采用微注射技術(shù)細胞器移植技術(shù)微注射法、載體轉(zhuǎn)移法、胞飲攝入法遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移基因在細胞水平上的轉(zhuǎn)移載體法：雙子葉植物常用直接導入法：直接將外源基因注入到一個受體的受精卵的核內(nèi)，合子發(fā)育成胚5.4.2細胞融合構(gòu)建環(huán)境工程菌細胞質(zhì)壁分離后去掉細胞壁所余下的部分結(jié)構(gòu)稱為原生質(zhì)體具備原有細胞的全部內(nèi)部結(jié)構(gòu)與生理性能，但完全無細胞壁，失去了細胞的剛性而呈球形，對滲透壓十分敏感容易吸收外來的DNA、蛋白質(zhì)等，對外界理化因子比較敏感原生質(zhì)體融合方法親本的選擇：選擇兩種適合于重組的親本菌株，選定適宜的遺傳標記原生質(zhì)體制備：選用適合的酶系，在等滲液中溶解細胞壁；真菌選用纖維素酶，細菌選用溶菌酶；注意對最佳條件的摸索原生質(zhì)體的再生：酶解后得到的原生質(zhì)體能夠在等滲的培養(yǎng)基中重建細胞壁，恢復細胞完整形態(tài)，并能生長、分裂的過程稱為再生；這是以融合法進行細胞遺傳結(jié)構(gòu)改造的前提；再生率差距很大原生質(zhì)體的融合與融合子的檢出化學誘導法：常用促融劑是聚乙二醇（PEG）及鈣離子PEG在相鄰原生質(zhì)體的流動質(zhì)膜之間形成一種分子橋，溝通兩個親本的質(zhì)膜，改變了質(zhì)膜的某些性質(zhì)，并降低了原生質(zhì)體的表面勢能，使質(zhì)膜上的蛋白質(zhì)凝聚，形成容易融合的無蛋白顆粒的磷脂雙層區(qū)，導致原生質(zhì)體進一步融合電融合法：快速、簡便、融合率高瞬時電脈沖使兩細胞接觸處的細胞膜發(fā)生破裂原生質(zhì)體融合構(gòu)建環(huán)境工程菌始于20世紀80年代，在生物降解反應(yīng)中，微生物細胞互生現(xiàn)象普遍存在；通過原生質(zhì)體融合技術(shù)將多個細胞的優(yōu)勢集中到一個細胞內(nèi)原生質(zhì)體融合構(gòu)建苯環(huán)化合物降解菌原生質(zhì)體融合構(gòu)建纖維素降解菌聚乙二醇誘導原生質(zhì)體融合制備細菌殺蟲劑電融合誘導選育利用木糖和纖維二糖產(chǎn)乙醇的菌株——5.5發(fā)酵工程5.5.1發(fā)酵概述發(fā)酵的定義發(fā)酵是微生物分解有機物，產(chǎn)生乳酸或乙醇和CO2的作用過程；也泛指一般利用微生物制造原料或產(chǎn)品的過程，可在無氧或有氧條件下進行利用發(fā)酵工程的原理與技術(shù)，同時實現(xiàn)廢物資源化，提高整體工藝的效益，降低運行成本發(fā)酵工程的基本原理單一的菌種在培養(yǎng)基中的純培養(yǎng)采用的菌種極為重要，培養(yǎng)與保存優(yōu)良的生產(chǎn)菌種是發(fā)酵工藝的首要任務(wù)發(fā)酵工程過程發(fā)酵原料的預處理發(fā)酵過程的準備發(fā)酵過程：厭氧發(fā)酵和好氧發(fā)酵產(chǎn)品的分離與純化：離心除雜，進一步提煉原料豐富，需要將其粉碎、蒸煮并水解成葡萄糖，以供給微生物利用種子罐發(fā)酵制備大量的微生物菌種；無菌消毒是種子制備與發(fā)酵的`必要條件；還需要調(diào)節(jié)pH和添加必要的營養(yǎng)鹽5.5.2發(fā)酵工程在環(huán)境污染治理中的應(yīng)用亞硫酸鹽紙漿廢液乙醇發(fā)酵酵母循環(huán)系統(tǒng)：利用酵母-活性污泥二段式好氧處理廢水的系統(tǒng)廢纖維素的資源化有機固體廢物的快速堆肥第六章水環(huán)境污染控制與治理中的生物化學——6.1污水、廢水生物控制與治理生物化學6.1.1水的生物化學