![第四章 生物信息的傳遞(下)―從mRNA到蛋白質(zhì)_第1頁(yè)](http://file4.renrendoc.com/view/f0b1baaac33ce7caaf858dcc460becfd/f0b1baaac33ce7caaf858dcc460becfd1.gif)
![第四章 生物信息的傳遞(下)―從mRNA到蛋白質(zhì)_第2頁(yè)](http://file4.renrendoc.com/view/f0b1baaac33ce7caaf858dcc460becfd/f0b1baaac33ce7caaf858dcc460becfd2.gif)
![第四章 生物信息的傳遞(下)―從mRNA到蛋白質(zhì)_第3頁(yè)](http://file4.renrendoc.com/view/f0b1baaac33ce7caaf858dcc460becfd/f0b1baaac33ce7caaf858dcc460becfd3.gif)
![第四章 生物信息的傳遞(下)―從mRNA到蛋白質(zhì)_第4頁(yè)](http://file4.renrendoc.com/view/f0b1baaac33ce7caaf858dcc460becfd/f0b1baaac33ce7caaf858dcc460becfd4.gif)
![第四章 生物信息的傳遞(下)―從mRNA到蛋白質(zhì)_第5頁(yè)](http://file4.renrendoc.com/view/f0b1baaac33ce7caaf858dcc460becfd/f0b1baaac33ce7caaf858dcc460becfd5.gif)
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第四章生物信息的傳遞(下)――從mRNA到蛋白質(zhì)1、遺傳密碼—三聯(lián)子2、tRNA3、核糖體4、蛋白質(zhì)合成的生物學(xué)機(jī)制5、蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制基本內(nèi)容:蛋白質(zhì)生物合成中的三大發(fā)現(xiàn)PaulZamecnik核糖體是蛋白質(zhì)生物合成的場(chǎng)所MahlonHoagland發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)FrancisCrick(1916-2004)
提出tRNA應(yīng)接器假說(shuō)概述★蛋白質(zhì)翻譯是基因表達(dá)的第二步★tRNA在翻譯過(guò)程中起“譯員”的作用★參與翻譯的RNA除tRNA外,還有rRNA和mRNA★tRNA既是密碼子的受體,也是氨基酸的受體★tRNA接受AA要通過(guò)氨酰tRNA合成酶及其自身的paracodon的作用才能實(shí)現(xiàn)★tRNA通過(guò)其自身的anticodon而識(shí)別codon★密碼子有自身的特性三聯(lián)體前兩個(gè)重要通用性搖擺性有一定的使用效率★多種翻譯因子組成翻譯起始復(fù)合物,完成翻譯的起始、延伸和終止,并且保證其準(zhǔn)確性RNA的種類(lèi)信使RNA(mRNA)核糖體RNA(rRNA)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)RNA按功能分:TCATGATTAAG
T
AC
TA
A
T
DNA的平面結(jié)構(gòu)圖細(xì)胞核中AG
T
AC
TA
A
T
DNA的一條鏈AGCUGACGGUUU游離的核糖核苷酸(原料)DNA解旋,以一條鏈為模板合成RNA細(xì)胞核中AG
T
AC
TA
A
T
AGCUGACGGUUU
DNA與RNA的堿基互補(bǔ)配對(duì):A——U;T——A;C——G;G—CRNA聚合酶細(xì)胞核中AG
T
AC
TA
A
T
AGCGACGGUUUU
組成
RNA的核糖核苷酸一個(gè)個(gè)連接起來(lái)細(xì)胞核中AG
T
AC
TA
A
T
GCGACGGUUUUA細(xì)胞核中AG
T
AC
TA
A
T
GCGACGUUGUUA細(xì)胞核中AG
T
AC
TA
A
T
GCGACGUGUUAA細(xì)胞核中AG
T
AC
TA
A
T
GCGACGGUUAAU細(xì)胞核中AG
T
AC
TA
A
T
GCGACGGUUAAUA細(xì)胞核中AG
T
AC
TA
A
T
GCGCGGUUAAUAU細(xì)胞核中AG
T
AC
TA
A
T
GGCGGUUAAUAUC細(xì)胞核中AG
T
AC
TA
A
T
GGCGGUUAAUAUCDNA上的遺傳信息就傳遞到mRNA上mRNADNA細(xì)胞核中AG
T
AC
TA
A
T
UCAUGAUUAmRNA
細(xì)胞質(zhì)
細(xì)胞核
核孔DNAmRNA在細(xì)胞核中合成AG
T
AC
TA
A
T
UCAUGAUUAmRNA
細(xì)胞質(zhì)
細(xì)胞核mRNA通過(guò)核孔進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)UCAUGAUUAmRNA蛋白質(zhì)的生物合成步驟翻譯的起始肽鏈的延伸肽鏈的終止及釋放核糖體與mRNA結(jié)合并與氨酰-tRNA生成起始復(fù)合物由于核糖體沿mRNA5’端向3’端移動(dòng),開(kāi)始了從N端向C端的多肽合成,這是蛋白質(zhì)合成過(guò)程中速度最快的階段核糖體從mRNA上解離,準(zhǔn)備新一輪合成反應(yīng)翻譯的動(dòng)態(tài)過(guò)程在合成的各個(gè)階段有許多蛋白質(zhì)、酶和其他生物大分子參與。參與蛋白質(zhì)合成的各種組分約占細(xì)胞干重的35%。在真核生物中有將近300種生物大分子與蛋白質(zhì)的生物合成有關(guān)。蛋白質(zhì)合成是一個(gè)需能反應(yīng),要有各種高能化合物的參與。細(xì)胞用來(lái)進(jìn)行合成代謝的總能量的90%消耗在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中。核糖體是蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所。mRNA是蛋白質(zhì)合成的模板。轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)是模板與氨基酸之間的接合體。在真核生物細(xì)胞核內(nèi)合成的mRNA,要運(yùn)送到細(xì)胞質(zhì),才能翻譯生成蛋白質(zhì)。所謂翻譯是指將mRNA鏈上的核苷酸從一個(gè)特定的起始位點(diǎn)開(kāi)始,按每3個(gè)核苷酸代表一個(gè)氨基酸的原則,依次合成一條多肽鏈的過(guò)程。蛋白質(zhì)合成速度很高。大腸桿菌只需要5s就能合成一條由100個(gè)氨基酸組成的多肽。4.1遺傳密碼――三聯(lián)子貯存在DNA上的遺傳信息通過(guò)mRNA傳遞為蛋白質(zhì)。mRNA上每3個(gè)核苷酸翻譯成蛋白質(zhì)多肽鏈上的一個(gè)氨基酸,這3個(gè)核苷酸稱(chēng)為密碼,也叫三聯(lián)子密碼翻譯時(shí)從起始密碼子AUG開(kāi)始,沿著mRNA5’→3’的方向連續(xù)閱讀密碼子,直至終止密碼子為止,生成一條具有特定序列的多肽鏈――蛋白質(zhì)4.1.1三聯(lián)子密碼及其破譯三種核苷酸代表一種氨基酸一種核苷酸代表一種氨基酸兩種核苷酸代表一種氨基酸4種氨基酸42=16種43=64種在模板mRNA中插入或刪除一個(gè)堿基,會(huì)改變?cè)撁艽a子以后全部氨基酸序列。若同時(shí)對(duì)模板進(jìn)行插入和刪除試驗(yàn),插入和刪除的堿基數(shù)一樣,后續(xù)密碼子序列就不會(huì)變化,翻譯得到的蛋白質(zhì)序列就保持不變(除了發(fā)生突變的那個(gè)密碼子所代表的氨基酸之外)。如果同時(shí)刪去3個(gè)核苷酸,翻譯產(chǎn)生少一個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),序列不發(fā)生變化。T4噬菌體rⅡ位點(diǎn)上兩個(gè)基因?qū)煵輭乃佬l(wèi)星病毒的研究發(fā)現(xiàn):其外殼蛋白亞基由400個(gè)氨基酸組成,而相應(yīng)的RNA片段長(zhǎng)約1200個(gè)核苷酸,與假設(shè)的密碼三聯(lián)子體系正好相吻合在20世紀(jì)60年代,由于體外蛋白質(zhì)合成體系的建立和核酸人工合成技術(shù)的發(fā)展,科學(xué)家花了幾年時(shí)間破譯了遺傳密碼,即確定了代表每種氨基酸的具體密碼
一、通用的三聯(lián)體密碼DNA遺傳信息mRNA蛋白質(zhì)遺傳密碼
1、Codon的特征a、概念:mRNA上連續(xù)排列的三個(gè)NT序列,編碼一個(gè)AA信息的遺傳單位b、具有四大生物系統(tǒng)(病毒、細(xì)菌、動(dòng)植物)的通用性和保守性(Mt除外)C、一個(gè)基因序列中,有不重疊性和無(wú)標(biāo)點(diǎn)性遺傳密碼的破譯
歸功于三個(gè)經(jīng)典的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn):體外翻譯系統(tǒng)的建立核苷酸結(jié)合技術(shù)核酸的人工合成體外翻譯系統(tǒng)尼倫伯格(.M.W.Nirenberg)ATP、GTP、AA*體外翻譯系統(tǒng)按一定的堿基比例來(lái)合成RNA。
堿基比為U:G=5:1,三聯(lián)體8種:UUU,UUG,UGU,GUU,GGG,GGU,GUG,UGG。UUU:UGG=(5′5′5):(5′1′1)=25:1UUU:UUG=5:1根據(jù)這樣的推測(cè),在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中以這種比例合成的mRNA產(chǎn)生的氨基酸的比例也應(yīng)是相應(yīng)的,這樣可以推測(cè)出密碼子的組成。如氨基酸測(cè)定結(jié)果:苯丙氨酸(UUU):半胱氨酸(UGU)=5:1苯丙氨酸(UUU):纈氨酸
(GUU)=5:1
體外翻譯系統(tǒng)核苷酸結(jié)合技術(shù)
實(shí)驗(yàn)為20組:
SerC14
、Leu、Lys、Arg………….(20種)
Ser、LeuC14、Lys、Arg………….Ser、Leu、LysC14、Arg………….……分析留在濾膜上的核糖體中的AA—tRNA和其相應(yīng)的模板
?此方法未能破譯全部的codon
(結(jié)合效率)Ser-C14….
Leu-C14
….
Lys-C14
….
Gly-C14
….
核苷酸結(jié)合技術(shù)核苷酸結(jié)合技術(shù)人工合成核苷酸
(作為模板,加入dNTP,據(jù)合成的多肽鏈的氨基酸組成,破譯氨基酸的密碼)柯臘拉(H.G.Khorana)(1922~)
表14-1
用二個(gè)或三個(gè)、四個(gè)核苷酸構(gòu)造重復(fù)共聚體來(lái)確定密碼子重復(fù)順序可組成的三聯(lián)密碼多肽的氨基酸組成(UC)nUCU-CUCSer-Leu(UUC)n(UUC);(UCU);(CUU)polyPhe,polySer,polyLeu(UUAC)n(UUA-CUU-ACU-UAC)Leu-Leu-Thr-Tyr4.1.2遺傳密碼的性質(zhì)1.連續(xù)性(commaless)遺傳密碼的特點(diǎn)編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的各個(gè)三聯(lián)體密碼連續(xù)閱讀,密碼間既無(wú)間隔也無(wú)重疊。
重疊密碼非重疊連續(xù)的密碼不連續(xù)的密碼基因損傷引起mRNA閱讀框架內(nèi)的堿基發(fā)生插入或缺失,可能導(dǎo)致框移突變(frameshiftmutation)。由于對(duì)mRNA外顯子的加工,造成mRNA與其DNA模板序列之間不匹配,使同一mRNA前體翻譯出序列、功能不同的蛋白質(zhì)。這種基因表達(dá)的調(diào)節(jié)方式稱(chēng)為mRNA編輯(mRNAediting)。mRNA編輯2.簡(jiǎn)并性(degeneracy)遺傳密碼中,除色氨酸和甲硫氨酸僅有一個(gè)密碼子外,其余氨基酸有2~4個(gè)或多至6個(gè)密碼子為之編碼。遺傳密碼的簡(jiǎn)并性
密碼子簡(jiǎn)并性的生物學(xué)意義:減少有害突變。
遺傳密碼的特異性主要取決于前兩位堿基。
GCUACUGCCACCGCAACAGCGACG
AlaThr3.通用性(universal)蛋白質(zhì)生物合成的整套密碼,從原核生物到人類(lèi)都通用。
有少數(shù)例外,如動(dòng)物細(xì)胞的線粒體、植物細(xì)胞的葉綠體。密碼的通用性進(jìn)一步證明各種生物進(jìn)化自同一祖先。
4.擺動(dòng)性(wobble)tRNA上反密碼子的第1位堿基與mRNA密碼子的第3位堿基配對(duì)時(shí),可以在一定范圍內(nèi)變動(dòng),即并不嚴(yán)格遵循堿基配對(duì)規(guī)律,這一現(xiàn)象稱(chēng)為擺動(dòng)性。酪5’5’3’AUGGUUUACACA酪氨酰-tRNA反密碼mRNA密碼與反密碼的堿基配對(duì)擺動(dòng)配對(duì)U
在密碼子與反密碼子的配對(duì)中,前兩對(duì)嚴(yán)格遵守堿基配對(duì)原則,第三對(duì)堿基有一定的自由度,可以“擺動(dòng)”為I(次黃嘌呤)時(shí)可識(shí)別3種密碼子為G或U時(shí)可以識(shí)別2種密碼子反密碼子第一位為A或C時(shí)只能識(shí)別1種密碼子三中讀二一般可分為三種情況:(1)第1,2兩個(gè)堿基形成6個(gè)氫鍵時(shí),可三中讀二。
如CCX,CGX,GCX和GGX(3)第1,2兩個(gè)堿基形成5個(gè)氫鍵時(shí),當(dāng)?shù)诙€(gè)堿基為嘧啶時(shí),可三中讀二;如UCX,ACX,CUX和GUX。
當(dāng)?shù)诙€(gè)堿基為嘌呤時(shí)則不能三中讀二,如CAX,
GAX,UGX和AGX。(2)第1,2兩個(gè)堿基形成4個(gè)氫鍵時(shí),不可三中讀二。如AAX,AUX,UAX和UUX如果有幾個(gè)密碼子同時(shí)編碼一個(gè)氨基酸,凡是第一、二位堿基不同的密碼子都對(duì)應(yīng)于各自獨(dú)立的tRNA。第一、二位堿基相同的密碼子,則共用一種tRNA原核生物中有30~45種tRNA真核細(xì)胞中存在50種左右tRNA4.2tRNA
tRNA為每個(gè)三聯(lián)密碼子翻譯成氨基酸提供了接合體;為準(zhǔn)確無(wú)誤地將所需氨基酸運(yùn)送到核糖體上提供了運(yùn)送載體(又被稱(chēng)為第二遺傳密碼)。各種tRNA形成三葉草形的二級(jí)結(jié)構(gòu)。三葉草形tRNA分子上有4條根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)或已知功能命名的手臂。4.2.1tRNA
最小的RNA,4S,70~80個(gè)base
1、tRNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)
1964Holly.R.鑒定出tRNAphe的二級(jí)結(jié)構(gòu)為三葉草形(77個(gè)NT)(1)三葉草結(jié)構(gòu)(4個(gè)臂4個(gè)環(huán))
a、氨基酸接受臂(aaacceptarm)——受體臂
?tRNA的5’與3’-末端堿基配對(duì)形成?3’端永遠(yuǎn)為不配對(duì)的CCA序列?最后的A的3’或2’-OH可以被氨?;?/p>
b、另外是D(DHU環(huán)雙氫脲嘧啶)環(huán)D臂c、含豐富的稀有堿基(約70余種堿基核糖殘基)反密碼子3’端鄰近部位………..反密碼子環(huán)反密碼子臂(anti—codonarm)附加臂(extraarm)TψC環(huán)TψC臂
其中附加臂通常是可變的
稀有堿基出現(xiàn)的頻率高,對(duì)于維持反密碼環(huán)的穩(wěn)定性、密碼子和反密碼子之間的配對(duì)很重要TψC環(huán)附加環(huán)反密碼子環(huán)DHU環(huán)aa接受臂(2)“L”形三級(jí)結(jié)構(gòu)---anti-codonarm位于”L”另一端,與結(jié)合在核糖體小亞基上的codonofmRNA配對(duì)b、“L”結(jié)構(gòu)域的功能---aaacceptarm位于“L”的一端,契合于核糖體的肽基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合位點(diǎn)PA,以利肽鍵的形成a、“L”構(gòu)型的結(jié)構(gòu)力
?二級(jí)結(jié)構(gòu)中的堿基堆積力和氫鍵?二級(jí)結(jié)構(gòu)中未配對(duì)堿基形成的氫鍵氫鍵維持了“L”型的結(jié)構(gòu)---TΨCloop&DHUloop位于“L”兩臂的交界處,
利于“L”結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定反密碼子臂AA受體臂TΨC臂D臂---“L”結(jié)構(gòu)中堿基堆積力大使其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定
wobblebase位于“L”結(jié)構(gòu)末端堆積力小自由度大使堿基配對(duì)搖擺2、tRNA的種類(lèi)(2)同工tRNA(isoacceptingtRNAs)
(1)起始tRNA和延伸tRNA
起始tRNA:
Prok中,攜帶甲酰甲硫氨酸(fMet)Euk中,攜帶甲硫氨酸(Met)
延伸tRNA:其他tRNA…..攜帶AA相同而反密碼子不同的一組tRNA
?不同的反密碼子識(shí)別AA的同義密碼?結(jié)構(gòu)上能被AA–tRNA合成酶識(shí)別的共性
(3)校正tRNA
無(wú)義抑制--也會(huì)造成對(duì)正常終止密碼子的通讀,產(chǎn)生比野生型長(zhǎng)的蛋白質(zhì)錯(cuò)義抑制tRNA要和正常的tRNA去競(jìng)爭(zhēng),因此成功率50%3、副密碼子與氨?;鵷RNA的合成(1)氨酰基tRNA的合成執(zhí)行著雙重功能
?為肽建的合成提供能量?執(zhí)行遺傳信息的解讀(2)AA–tRNA合成酶(AARS)
★需要三種底物AAtRNAATP氨?;ctRNA的3’端A的2’/3’—OH結(jié)合AA–tRNA+AMP+ppiAARS★因此有三個(gè)位點(diǎn)
aabindingsitetRNAbindingsiteATPsite
★
反應(yīng)為AA+tRNA+ATP
★Prok中AARS有20種,對(duì)AA專(zhuān)一(同工受體)★Prok和Euk有一定的差別★可分為兩類(lèi)反應(yīng)機(jī)制的差別:
TypeⅠ類(lèi)酶先將氨酰基轉(zhuǎn)移到
tRNA3’端A的2’-OH然后通過(guò)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)轉(zhuǎn)移到3’–OH上TypeⅡ類(lèi)酶直接將氨?;D(zhuǎn)移至3’–OH上兩類(lèi)酶與tRNA反應(yīng)時(shí)--接近模式不同合成酶與tRNA相互束縛的普通模型提出:蛋白沿L型分子的一側(cè)束縛tRNA(tRNA的兩端被束縛)1型與tRNA的D-環(huán)結(jié)合,識(shí)別其受體臂的小溝2型在另一側(cè)結(jié)合,識(shí)別可變環(huán)和受體臂的大溝(3)Paracodon(副密碼子)的概念;tRNA中決定負(fù)載特定氨基酸的空間密碼AARStRNAbindingsiteaabindingsiteParacodonoftRNA裝載AminoAcid(R)tRNA中的特定序列與AARS的tRNAbindingsite的特異基團(tuán)間的分子契合a、
1988.Schimmel和侯雅明G3:U70
是決定tRNA負(fù)載
Ala
的特異密碼信息b、1991.schummanL.
證明;tRNAmetf的paracodon位于anti-codonc、
paracodon的特征---為同一種AARS所識(shí)別的一組同功受體具有相同的副密碼子---paracodon是為AARS(特定氨基酸)所識(shí)別的若干堿基(并非均為一對(duì)核苷酸)---AARS對(duì)paracodon的識(shí)別與結(jié)合是通過(guò)氨基酸與堿基之間的連接實(shí)現(xiàn)的。屬于生物
II型空間密碼tRNA
Ala(GGC)tRNAAla(UGC)具有G3:U70
paracodond、按氨基酸序列將AARS分為兩類(lèi)typeI
包括Val,Arg,Gln,Glu,Ile,Leu,Met,Trp,Tyrparacodon大多位于反密碼子臂typeIIparacodon大多位于氨基酸接受臂個(gè)別還同時(shí)在附加臂上有相應(yīng)堿基4.2.2tRNA的功能轉(zhuǎn)錄:DNA→RNA;結(jié)構(gòu)上相似;堿基配對(duì);一對(duì)一翻譯:mRNA→蛋白質(zhì);結(jié)構(gòu)極不相同;復(fù)雜功能一:tRNA的解碼機(jī)制完成翻譯AAAA-tRNAmRNA-核糖體復(fù)合物AA-tRNA合成酶ATP密碼子與反密碼子識(shí)別配對(duì)功能二:tRNA是AA與mRNA的接合體4.3核糖體執(zhí)行蛋白質(zhì)合成的功能。由幾十種蛋白質(zhì)和幾種核糖體RNA(rRNA)組成的亞細(xì)胞顆粒。一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)約有20000個(gè)核糖體,真核細(xì)胞內(nèi)可達(dá)106個(gè)。AA-tRNA進(jìn)入核糖體和退出核糖體進(jìn)行新一輪循環(huán)核糖體AA-tRNA與mRNA模板和延伸中的肽鏈相互作用迅速起始或延伸因子作用卸去所載氨基酸t(yī)RNA退出核糖體新一輪反應(yīng)
4.3.1核糖體及rRNA的結(jié)構(gòu)
Euk中大多與細(xì)胞骨架和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合在一起(游離、多聚)●是翻譯進(jìn)行的場(chǎng)所,含大小亞基●Prok.protein約占細(xì)胞的10%,RNA占總RNA的80%,Euk中相對(duì)比例小些●細(xì)菌中常以多聚核糖體的形式1、核糖體的結(jié)構(gòu)
(2)核糖體的裝配
(1)ProkE.coli小亞基16SRNA21種proteinsS1-------S21大亞基23SRNA5SRNA34種proteinsL1----L34
Euk大亞基28SRNA5SRNA5.8SRNA49種proteins小亞基18SRNA33種proteins核糖體蛋白質(zhì)+rRNA-----按一定的順序形成完整的核糖體按一定順序結(jié)合rRNAs是亞基中的骨架蛋白質(zhì)和rRNA必須形成完整的核糖體結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮各自的功能除去Mg2+添加Mg2+2、核糖體的活性位點(diǎn)30S小亞基
頭部基底部中間有一豁口
50S大亞基
三個(gè)突起
頭部基底部小亞基大亞基前緣脊背中央隆起背部柄脊背核糖體蛋白大腸桿菌核糖體小亞基由21種r-蛋白組成,用S1……….S21表示,大亞基由36(34)種r-蛋白組成,分別用L1……L36表示,真核生物中,大亞基含有49種r-蛋白,小亞基由33種r-蛋白組成。?根據(jù)功能將核糖體上的活性部位分為兩類(lèi)?翻譯區(qū)域7個(gè)活性位點(diǎn)占2/3
?逐出位點(diǎn)2個(gè)位點(diǎn)(多肽的逐出)占1/3
(1)mRNA結(jié)合位點(diǎn)
a、位于30S亞基的頭部b、S1(可防止mRNA鏈內(nèi)堿基對(duì)的形成)(與S18和S21-結(jié)合-mRNA、起始tRNA、IF3)核糖體的功能部位c、16SrRNA3’端是mRNA與小亞基初始結(jié)合不可缺少的(2)P位點(diǎn):肽酰-tRNA位點(diǎn)
a、大部分在小亞基內(nèi),小部分在大亞基內(nèi)16SrRNA的3’末端、L2等蛋白b、能夠與起始tRNA(fMet--tRNAfMet)相結(jié)合,且P位點(diǎn)會(huì)影響A位點(diǎn)的活性
(3)A位點(diǎn):氨?;鵷RNA位點(diǎn)
a、主要在大亞基上
b、A位點(diǎn)內(nèi)mRNA表面只對(duì)特定的AA—tRNA分子表現(xiàn)出特異性,且A位點(diǎn)結(jié)合aa—tRNA要求在P位點(diǎn)上必須有肽酰tRNA存在
(4)肽基轉(zhuǎn)移酶活性位點(diǎn)
活性中心在大亞基上,位于P位點(diǎn)和A位點(diǎn)的連接處靠近tRNA的接受臂
(5)5srRNA位點(diǎn)(與tRNA進(jìn)入有關(guān))(6)EF—Tu位點(diǎn)
位于大亞基內(nèi),與氨?;鵷RNA的結(jié)合有關(guān)(7)EF—G轉(zhuǎn)位因子結(jié)合位點(diǎn)
大亞基靠近小亞基的界面處(8)E位點(diǎn)(包括兩個(gè):脫?;鵷RNA和多肽的逐出位點(diǎn))
?E1為脫?;鵷RNA離開(kāi)核糖體提供出口?E1對(duì)蛋白質(zhì)合成的準(zhǔn)確性起重要作用?E2為多肽離開(kāi)核糖體提供出口(占核糖體1/3)延伸因子的結(jié)合位點(diǎn)PeptidyltransferaseEF-TusiteE2位點(diǎn)膜fMet--tRNAmetf(Met--tRNAmeti)wayinPsite脫酰基tRNA轉(zhuǎn)移至E位點(diǎn)使A位點(diǎn)出現(xiàn)有利于新的氨酰-tRNA結(jié)合的構(gòu)象(空間結(jié)構(gòu)改變);當(dāng)新的氨酰-tRNA與A位點(diǎn)結(jié)合后,使E位點(diǎn)結(jié)構(gòu)改變,脫?;?tRNA脫離E位點(diǎn)4.3.2rRNA5SrRNA細(xì)菌5SrRNA含有120或116個(gè)核苷酸5SrRNA有兩個(gè)高度保守的區(qū)域其中一個(gè)區(qū)域含有保守序列CGAAC,這是與tRNA分子TψC環(huán)上的GTψCG序列相互作用的部位,是5SrRNA與tRNA相互識(shí)別的序列另一個(gè)區(qū)域含有保守序列GCGCCGAAUGGUAGU,與23SrRNA中的一段序列互補(bǔ),這是5SrRNA與50S核糖體大亞基相互作用的位點(diǎn)16SrRNA長(zhǎng)度在1475-1544個(gè)核苷酸之間,含有少量修飾堿基。該分子全部壓縮在30S小亞基內(nèi)3‘端一段ACCUCCUUA的保守序列,與mRNA5’端翻譯起始區(qū)富含嘌呤的序列互補(bǔ)靠近3'端處還有一段與23SrRNA互補(bǔ)的序列,在30S與50S亞基的結(jié)合中起作用23SrRNA包括2904個(gè)核苷酸在大腸桿菌23SrRNA第1984~2001核苷酸之間,存在一段能與tRNAMet序列互補(bǔ)的片段,表明核糖體大亞基23SrRNA與tRNAMet的結(jié)合有關(guān)靠近5'端(143-157位核苷酸之間)有一段12個(gè)核苷酸的序列與5SrRNA上第72-83位核苷酸互補(bǔ),表明在50S大亞基上這兩種RNA之間可能存在相互作用。核糖體50S大亞基上約有20種蛋白質(zhì)能不同程度地與23SrRNA相結(jié)合5.8SrRNA長(zhǎng)度為160個(gè)核苷酸,含修飾堿基。真核生物大亞基特有含有保守序列CGAAC(原核5SrRNA),可能是與tRNA作用的識(shí)別序列人類(lèi)基因組中18S和5.8SrRNA基因的數(shù)量大大低于原來(lái)的估計(jì)18SrRNA酵母18SrRNA由1789個(gè)核苷酸組成3'端與大腸桿菌16SrRNA有廣泛的同源性其中酵母18SrRNA、大腸桿菌16SrRNA和人線粒體12SrRNA在3’端有50個(gè)核苷酸序列相同位于真核生物小亞基內(nèi),與原核16SrRNA類(lèi)似28SrRNA長(zhǎng)度約在3890~4500bp左右,具體功能不清綜上,rRNA之間以及rRNA與tRNA及mRNA之間存在有機(jī)的聯(lián)系,這種關(guān)系是建立在序列互補(bǔ)或同源的基礎(chǔ)之上的4.3.3核糖體的功能核糖體存在于每個(gè)進(jìn)行蛋白質(zhì)合成的細(xì)胞中。盡管在不同生物體內(nèi)其大小有別,但組織結(jié)構(gòu)基本相同,而且執(zhí)行的功能完全相同。核糖體小亞基功能對(duì)模板mRNA進(jìn)行序列特異性識(shí)別提供mRNA的結(jié)合位點(diǎn)大腸桿菌中與翻譯真實(shí)性有關(guān)的蛋白質(zhì)S4及S12也屬小亞基核糖體大亞基功能負(fù)責(zé)攜帶AA及tRNA肽鍵的形成AA-tRNA、肽基-tRNA的結(jié)合A位、P位、轉(zhuǎn)肽酶中心等在大亞基上核糖體游離大小亞基70S/80S的顆粒翻譯起始翻譯進(jìn)程肽鏈釋放核糖體(70S)游離大小亞基70S/80S的顆粒Mg2+<10-3mol/LMg2+≈10-2mol/L大腸桿菌體外反應(yīng)體系4.4蛋白質(zhì)合成的生物學(xué)機(jī)制蛋白質(zhì)是生物活性物質(zhì)中最重要的大分子組分,生物有機(jī)體的遺傳學(xué)特性要通過(guò)蛋白質(zhì)來(lái)得到表達(dá)。蛋白質(zhì)的生物合成包括氨基酸活化、肽鏈的起始、伸長(zhǎng)、終止以及新合成多肽鏈的折疊和加工,現(xiàn)將各階段的必需成分列于下表。4.4.1氨基酸的活化第一步反應(yīng)第二步反應(yīng)AA+tRNAAA-tRNAATP
AMP+PPi氨酰-tRNA合成酶Mg2+AA-AMP-E+tRNAAA-tRNA+AMP+EAA+ATP+
EAA-AMP-E+AMP+PPi
第一步反應(yīng)AA+ATP+
E—→AA-AMP-E+AMP+PPi
第二步反應(yīng)AA-AMP-E+tRNA—→
AA-tRNA+AMP+E
TypeⅠ類(lèi)酶先將氨?;D(zhuǎn)移到tRNA3’端A的2’-OH然后通過(guò)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)轉(zhuǎn)移到3’–OH上TypeⅡ類(lèi)酶直接將氨?;D(zhuǎn)移至3’–OH上◆高度特異性(活化位點(diǎn))對(duì)氨基酸有極高的專(zhuān)一性對(duì)tRNA具有極高專(zhuān)一性反密碼子第二套遺傳密碼系統(tǒng)◆校對(duì)作用(水解位點(diǎn))◆只作用于L-氨基酸t(yī)RNA氨基酰-tRNA合成酶ATP氨基酰tRNA合成酶(aminoacyl-tRNAsynthetase,aaRS)◆存在于所有的生物體,定位于胞液中◆與特異氨基酸的活化以及氨基酰tRNA的合成有關(guān)IleHCOOH
CH3—CH2—C—CHCH3NH2
ValHCOOH
CH3—C—CH
CH3NH2
Ile-RSInvitro
200X1X∨Val-tRNAIle錯(cuò)誤負(fù)載機(jī)率
1/200
!Invivo
Val:Ile=5:1
但實(shí)際測(cè)定的錯(cuò)譯機(jī)率僅為1/12000?!
Val-tRNAIle錯(cuò)誤負(fù)載機(jī)率1/40!!Val:Ile=1:1(異亮氨酸)(纈氨酸)IVBHVal—AMPBHBHaa-tRNAloadingBHVIIle分子構(gòu)型大于Val
Val進(jìn)入B位點(diǎn)并進(jìn)入H位點(diǎn)而被降解Ile進(jìn)入B位點(diǎn)但不能進(jìn)入H位點(diǎn)B,結(jié)合位點(diǎn)H,水解位點(diǎn)◆AA-tRNA的表示方法:Ala-tRNAAla
Ser-tRNASerMet-tRNAMet
◆起始肽鏈合成的AA-tRNA真核生物:Met-tRNAiMet原核生物:fMet-tRNAffMet蛋白質(zhì)合成起始需要:
核糖體大、小亞基起始tRNA幾十個(gè)蛋白質(zhì)因子ATP、Mg2+參與翻譯的蛋白質(zhì)因子階段原核真核功能起始IF1IF2eIF2參與起始復(fù)合物的形成IF3eIF3、eIF4CCBPI與mRNA帽子結(jié)合
eIF4ABF參與尋找第一個(gè)AUG
eIF5協(xié)助eIF2、eIF3、eIF4C的釋放
eIF6協(xié)助60S亞基從無(wú)活性的核糖體上解離延長(zhǎng)EF-TueEF1
協(xié)助氨酰-tRNA進(jìn)入核糖體EF-TseEF1
幫助EF-Tu、eEF1
周轉(zhuǎn)EF-GeEF2移位因子終止RF-1eRF釋放完整的肽鏈RF-2因子前加“e”表示真核生物(eukaryotic)原核生物起始復(fù)合物形成:30S+mRNA=mRNA30S+fMet-tRNAifMet=mRNA30SfMet-tRNAifMet+50S=mRNA30SfMet-tRNAifMet50S真核生物起始復(fù)合物形成:40S+=mRNA40S+Met-tRNAiMet=mRNA40SMet-tRNAiMet+60S=mRNA40SMet-tRNAiMet60SMet-tRNAiMet起始復(fù)合物的生成需要:
GTP提供能量Mg2+、NH4+3個(gè)起始因子(IF-1、IF-2、IF-3
)與30S小亞基結(jié)合松散,用1mol/LNH4Cl可解離4.4.2翻譯的起始細(xì)菌中翻譯的起始需要如下7種成分:①30S小亞基,②模板mRNA,③fMet-tRNAfMet,④3個(gè)翻譯起始因子(IF-l、IF-2和IF-3),⑤GTP,⑥50S大亞基,⑦M(jìn)g2+。翻譯起始又可被分成3步。核蛋白體大小亞基分離IF-3IF-1核蛋白體大小亞基分離mRNA在小亞基定位結(jié)合S-D起始氨基酰tRNA結(jié)合到小亞基S-D核蛋白體大亞基結(jié)合形成起始復(fù)合物IF-2GDPPPiIF-3IF-1真核生物翻譯起始復(fù)合物形成60S40SeIF-2BeIF-3eIF-6①60S40SeIF-3②Met40SMet40SMet40SMetmRNA③④eIF-5Met-tRNAiMet-eIF-2-GTPATPADP+PieIF4E,eIF4G,eIF4B,eIF4A,PAB各種eIF釋放ADP+Pi1、起始tRNA與起始密碼子的識(shí)別(1)細(xì)菌
?tRNAMetf能識(shí)別AUG、GUG?tRNAMetf+Met……….fMet---tRNAf
轉(zhuǎn)甲酰酶?tRNAMetm識(shí)別內(nèi)部的AUG,內(nèi)部GUG由tRNAValm識(shí)別
(2)Euk中tRNAMeti
tRNAMetm
?tRNAfMetf接受臂的兩個(gè)堿基均為不配對(duì)狀態(tài)(3)線粒體中Met甲?;?)tRNAfMetf和tRNAMetm結(jié)構(gòu)上存在差異
?tRNAfMetf.....TψCA,而tRNAMetm…..TψCG
?反密碼子的3’端臨位tRNAfMetf…AtRNAMetm…烷基化的A起始tRNA的結(jié)構(gòu)G-CG烷基化的A2、起始復(fù)合物的生成(1)起始因子及30S亞基與mRNA的結(jié)合
?Prok.的三種起始因子(initiationfactorIF)參與蛋白質(zhì)合成起始的可溶性蛋白因子--輔助起始復(fù)合物:核糖體、mRNA、aa--tRNA三元復(fù)合物
三種IF分別為:IF1IF2IF3IF1---------加強(qiáng)IF2、IF3的酶活I(lǐng)F2---------促使fMet---tRNAMetf選擇性的結(jié)合在30S亞基上
30S---IF3+mRNA30S+IF3+mRNA(30S復(fù)合物)IF3---------促使30S亞基結(jié)合于mRNA起始部位,阻止30S亞基與50S亞基的結(jié)合,或者說(shuō)促進(jìn)70S核糖體的解離a、30S亞基與mRNA的結(jié)合
IF3+30S☆I(lǐng)F3--賦予30S亞基與mRNA結(jié)合的能力
(30S亞基沒(méi)有與mRNA主動(dòng)結(jié)合的能力)
☆SD序列控制起始復(fù)合物形成的頻率……翻譯產(chǎn)物數(shù)量☆I(lǐng)F3使30S亞基不能與50S亞基結(jié)合(形狀…..)☆30S亞基與mRNA的結(jié)合SD與16SrRNA的3’端………☆30S復(fù)合物中,起始codon正好位于P位點(diǎn),且只有fMet—tRNAfMetf才能進(jìn)入
(2)起始tRNA的結(jié)合
IF2+fMet---tRNAfIF2---fMet---tRNAf+30S---IF3---mRNA30S---IF3---mRNA---IF2---fMet---tRNAf---GTP
GTP
◆IF2與起始tRNA之間作用嚴(yán)格專(zhuān)一很強(qiáng)的GTP酶活性
(3)70S起始復(fù)合物的形成
a、IF3游離
30S---IF3---mRNA---IF2---fMet---tRNAf---GTP
與50S亞基的結(jié)合導(dǎo)致(IF3與50S亞基的競(jìng)爭(zhēng))b、70S起始復(fù)合物形成
50S亞基的結(jié)合激活I(lǐng)F2的GTP酶活性,水解GTP并解離下來(lái)(IF1)GTP水解釋放的能量改變兩者的構(gòu)象IF---輔助因子形成30S---mRNA---fMet---tRNA---50S
IF2---fMet---tRNAf結(jié)合上來(lái)c、Met的甲?;某ァ?.合成到15~30個(gè)AA3、Euk蛋白質(zhì)合成的起始
(1)機(jī)制與Prok.基本相同,差異主要是所涉及的因素本身的差異所導(dǎo)致◎去甲酰基酶(細(xì)菌、線粒體)◎氨肽酶去除Met甲?;被彪拿溉ゼ柞;竌、核糖體較大b、mRNA是單順?lè)醋觕、其mRNA具有m7GpppNp帽子結(jié)構(gòu),從而導(dǎo)致起始時(shí)識(shí)別信號(hào)的差異d、Met---tRNAMet不甲?;痚、有較多的起始因子(2)Euk蛋白質(zhì)合成的起始因子(3)起始機(jī)制
對(duì)AUG的識(shí)別涉及:Euk蛋白質(zhì)合成起始中的重要參與者:
*密碼子與反密碼子的配對(duì)*起始AUG上下文結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的作用
Met—tRNAi核糖體AUG上下文特點(diǎn)
eIF–2作用eIF-4F修飾的帽子小亞基連接到修飾的帽子小亞基遷移到連接位點(diǎn)eIF-2MetMetMet4.4.3肽鏈的延伸
EF—Tu--GTP+AA--tRNA三元復(fù)合物起始tRNA不能結(jié)合,保證了……..Prok肽鏈的延伸以氨酰-tRNA進(jìn)入70S起始復(fù)合物的A位為標(biāo)志(第一個(gè)進(jìn)位過(guò)程)
1、后續(xù)AA-tRNA與核糖體結(jié)合(1)三元復(fù)合物生成
EF—Tu+GTP
AA--tRNA·EF—Tu·GTPmRNA內(nèi)部的AUG不會(huì)被起始tRNA讀出,肽鏈中間不會(huì)出現(xiàn)甲酰甲硫氨酸
(2)三元復(fù)合物進(jìn)入A位
§要求P位點(diǎn)被起始氨酰tRNA或肽酰-tRNA占據(jù)§同時(shí),EF-Tu催化GTP水解,釋放EF—Tu—GDP
(3)Ts循環(huán)(Tu—Ts循環(huán))
EF—Ts能夠使EF—Tu—GDP轉(zhuǎn)變?yōu)镋F—Tu—GTP因?yàn)?----EF—Tu—GDP不能有效地結(jié)合氨?;猼RNA
循環(huán)過(guò)程:EF—Tu—GDPEF--TsEF—Tu—EF--TsGTP取代EF—Tu--GTP2、肽鍵生成(轉(zhuǎn)肽反應(yīng))(1)肽酰轉(zhuǎn)移酶(peptidyltransferase)
☆位于核糖體大亞基,催化肽鍵生成☆若干蛋白質(zhì)、23SrRNA、5SrRNA
(2)形成過(guò)程:
把兩個(gè)氨酰-tRNA定位于調(diào)準(zhǔn)的位置將處于P位的甲酰甲硫氨?;螂孽;D(zhuǎn)移到A位的氨?;璽RNA的氨基上形成肽鍵肽鏈延伸一個(gè)AA進(jìn)位TuTsGTP是指根據(jù)mRNA下一組遺傳密碼指導(dǎo),使氨基酰-tRNA進(jìn)入核蛋白體A位fMetGTPTuGDPTsGTPfMetE位fMet轉(zhuǎn)位(成肽)是轉(zhuǎn)肽酶催化的肽鍵形成的過(guò)程E位fMet移位在轉(zhuǎn)位酶的作用下,促進(jìn)核糖體向mRNA的3‘測(cè)移動(dòng),使新形成的肽酰tRNA和mRNA相對(duì)位移由A位進(jìn)入核蛋白體P位,而卸載的tRNA進(jìn)入E位E位fMetAA3TuGTP移位進(jìn)位轉(zhuǎn)位移位
(1)需要GTP和延伸因子EF—Ga、過(guò)程:EF—G和GTP結(jié)合-------核糖體中具有GTP酶活性的蛋白GTP水解
--------A位生成的肽基轉(zhuǎn)移到P位,P位空載的tRNA進(jìn)入E位
(此過(guò)程mRNA移動(dòng)了一個(gè)密碼子)3、移位(translocation)
⊙肽鍵生成后,核糖體沿mRNA向前移動(dòng)一個(gè)密碼子的距離
◎延伸的實(shí)質(zhì):即核糖體沿mRNA移動(dòng)的實(shí)質(zhì)---tRNA的移動(dòng)tRNA和mRNA以相同的方向沿核糖體移動(dòng)b、EF—G和GDP必須釋放→→→下一個(gè)三元復(fù)合物進(jìn)位c、抗生素甾酸酶素(fusidicacid)實(shí)驗(yàn)證實(shí)d、核糖體固有的移位性質(zhì)可被EF—G所催化抗生素甾酸酶素能使核糖體停在移位后的狀態(tài)(其穩(wěn)定了EF-G與GDP核糖體的構(gòu)象)實(shí)驗(yàn)表明:EF—G不存在時(shí)核糖體也可以發(fā)生移位延伸4、兩類(lèi)延伸因子的交替作用使肽鍵生成和移位有條不紊的進(jìn)行★EF—G和GTP的結(jié)合要求EF—Tu離開(kāi)核糖體,新的氨酰基-tRNA進(jìn)入A位要求EF-G離開(kāi)核糖體★氨?;猼RNA三元復(fù)合物(EF--Tu)進(jìn)入A位點(diǎn)必須要求P位點(diǎn)被肽?!猼RNA占據(jù)而A位點(diǎn)空載
EF—G和GTP結(jié)合……..只有在肽鍵生成后,肽基轉(zhuǎn)移到A位、P位tRNA空載★兩種延伸因子交替與核糖體發(fā)生相互作用,使肽鍵生成和移位有條不紊的進(jìn)行5、Euk肽鏈的延伸(1)與Prok相似﹡eEF—1取代EF—Tu和EF—Ts﹡eEF—2取代EF—G﹡真菌------eEF—3參與(維持翻譯的準(zhǔn)確性)(2)eEF—1大多數(shù)由α、β、γ、δ四個(gè)亞基eEF--1α----與GTP結(jié)合﹡酵母中過(guò)量表達(dá)可導(dǎo)致翻譯忠實(shí)性的提高、果蠅中可延長(zhǎng)其壽命﹡衰老過(guò)程中,eEF—1α活性下降因此-------衰老過(guò)程中可能伴隨著翻譯忠實(shí)性的下降﹡大量表達(dá)還可以提高細(xì)胞的生長(zhǎng)能力一些影響細(xì)胞生長(zhǎng)的因素也可以引起細(xì)胞內(nèi)eEF—1α的大量表達(dá),如:癌基因v—fos的誘導(dǎo)(3)有些資料表明:eEF—2并不是延伸所必須,只起到加速的作用6、GTP的作用(1)使各種翻譯因子與tRNA或核糖體易于以非共價(jià)鍵結(jié)合;水解成GDP和Pi的反應(yīng)是釋放結(jié)合因子的信號(hào)Prok------IF2、EF—Tu、EF—GEuk------eIF—2、eEF—1、e
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