第7章 RNA遺傳 - 副本

分子遺傳學(xué)

MolecularGenetics

第7章RNA遺傳

中國醫(yī)科大學(xué)

醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室

李福才

2013.3

1第7章RNA遺傳

7.1RNA世界——生命早期的遺傳物質(zhì)

7.2RNA干涉/干擾現(xiàn)象

7.3RNAi對基因表達(dá)的作用

7.4RNA編輯RNA遺傳在中心法則中，RNA只是作為一個中間環(huán)節(jié)被描述，真正的遺傳模板是DNA。但是，20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶以后，在Crick修正后的中心法則中，可以看到RNA已不是過去的中間環(huán)節(jié)，而是具有與DNA同等地位的遺傳模板。

然而，RNA編輯、RNA干擾的發(fā)現(xiàn)與研究，更使我們對RNA的遺傳作用刮目相看。

著名的分子生物學(xué)家Pennisi指出：“基因占據(jù)生物學(xué)的舞臺已經(jīng)數(shù)十年。但最近的工作提出，雖然基因經(jīng)常是掛牌的名角，可它們更像一些木偶。各種蛋白質(zhì)，有時是RNAs，在拉著線，告訴基因在何時何地打開或關(guān)閉”。7.1RNA世界——生命早期的遺傳物質(zhì)

RNA世界假說認(rèn)為，在生命進(jìn)化早期沒有蛋白酶，某些RNA序列可以催化RNA的復(fù)制。也就是說，RNA是生命早期的唯一遺傳物質(zhì)，它是生命的源頭。

在RNA遺傳的基礎(chǔ)上，才有了后來的DNA與蛋白質(zhì)體系。事實上，RNA的遺傳作用并未在生命的進(jìn)化中消失，在一定程度，RNA仍在支配著DNA與蛋白質(zhì)的命運。

Johnston等的工作證明，某種RNA分子確實能夠催化RNA復(fù)制中的多聚化。

應(yīng)用NTP及RNA模板的編碼信息，使RNA引物持續(xù)增加14個核苷酸長度，等于RNA螺旋一圈。這種多聚化是RNA模板依賴的，是按照引物的序列、長度，以及RNA模板的信息進(jìn)行的。證明了引物的3′是在與RNA模板逐一地、嚴(yán)格地配對的情況下進(jìn)行的。結(jié)果，多聚化過程是逼真的；在引物被擴(kuò)展11個核苷酸的情況下，對此等序列進(jìn)行了克隆和序列分析，在1100個樣品中有1088個是與模板標(biāo)準(zhǔn)匹配的。如表7.1

Bartel等使用存在于隨機(jī)RNA序列的備用池中的RNA-連接酶ribozymes衍生物。某些衍生物能夠使用NTP及RNA模板的部分區(qū)域進(jìn)行模板指導(dǎo)的引物延伸。這些連接酶衍生物通過與模板的不配對的以特異小段的雜交來識別并催化該引物---模板復(fù)合體的RNA復(fù)制。從使用的模板的一小段來指導(dǎo)引物延伸來看，這些ribozymes不像復(fù)制RNA/DNA的酶的多聚化反應(yīng)，更類似于末端酶。從上述可知，W.K.Johnston等所描述的RNA復(fù)制雖然效率不高，卻是真正的RNA自我復(fù)制。因為它不像DNA復(fù)制那樣，需要許多蛋白酶來進(jìn)行加工。而這里的RNA復(fù)制，它不需要任何蛋白質(zhì)，完全由RNA酶(ribozymes)及RNA模板完成。

而通常的DNA/RNA病毒的復(fù)制以及細(xì)胞DNA復(fù)制都不是由純粹的DNA或RNA系統(tǒng)完成的。因此，RNA無疑地是一種復(fù)制模板。圖7.3RNA復(fù)制實驗7.2RNA干涉/擾7.2.1RNAi的分子機(jī)制RNA對基因表達(dá)的調(diào)控稱為RNA干擾（RNAinterference,RNAi）。

RNAi是一種轉(zhuǎn)錄后的基因沉默現(xiàn)象（post-transcriptionalgenesilencing,PTGS）,是dsRNA觸發(fā)細(xì)胞質(zhì)中與其同源的mRNA的降解，或在細(xì)胞核中dsRNA誘導(dǎo)同源的DNA的后生修飾（甲基化）而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平上的沉默。

RNA沉默是一種阻遏外來序列的有效手段，并在動、植物發(fā)育中有重要作用。

1998年FireA.和MelloC.C在線蟲中發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象。獲得2006年Nobel醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎。RNAi作用機(jī)制：

在不同的生物中，不同來源的雙鏈RNA(dsRNA，約500bp)被DICER（含有螺旋酶，helicase，dsRNA結(jié)合域，及PAZ功能域）裂解為一種具特異序列的有活性中間體---21~23nt的雙鏈siRNA（smallinterferingRNAs或guideRNAs）。

然后，siRNA結(jié)合核酸酶復(fù)合物（RISC的蛋白質(zhì)部分）形成RNA誘導(dǎo)復(fù)合物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC）。激活的RISC依靠siRNA中的一條鏈（GuideStrand）去尋找互補的mRNA鏈，然后RISC中的核酸內(nèi)切酶（Augonate2,Ago2）在距離siRNA3＇端12bp的位置切割mRNA。

RNAi的分子遺傳機(jī)制

基因mut-7及rde-2如果發(fā)生突變則導(dǎo)致內(nèi)源轉(zhuǎn)座子在生殖細(xì)胞中動員，稱之為増變現(xiàn)象。說明RNAi過程是造成轉(zhuǎn)位子抑制的原因。如果基因rde-1和rde-4發(fā)生突變，則對線蟲注射dsRNA后缺乏產(chǎn)生RNAi的響應(yīng)，在生殖細(xì)胞中也不能動員轉(zhuǎn)位子。dsRNA被轉(zhuǎn)換為特異序列中間體（R）,然后引起同源的mRNA降解/沉默。rde-1及rde-4為從dsRNA產(chǎn)生R所需要，mut-7及rde-2則被需要來響應(yīng)R使靶mRNA沉默。7.2.2siRNA的產(chǎn)生與擴(kuò)增

在線蟲中，小量的dsRNA能夠作用于大量的靶mRNA。這是因為dsRNA在轉(zhuǎn)變?yōu)閟iRNA的過程中，至少有三種擴(kuò)增途徑。

1）Dicer酶可以把長的dsRNA截成10~20段，等于擴(kuò)增10~20倍。2）存在一種催化機(jī)制，siRNA常常成倍增加，以用于進(jìn)一步擴(kuò)增。3）短的RNAs能作為靶mRNA的引物，在RNA依賴的RNA多聚酶的作用下，啟動一個RNA指導(dǎo)的RNA多聚化反應(yīng)，隨后產(chǎn)生許多“次級siRNAs，稱為靶指導(dǎo)的擴(kuò)增。（圖7.7）

首先dsRNA被切成短的siRNA,使dsRNA轉(zhuǎn)換成ssRNA。這些單鏈正常的siRNA如果沒有識別同源的靶mRAN，并與之配對，就會被降解。

一旦反義的siRNA與靶mRNA配對，則靶-指導(dǎo)的siRNA的擴(kuò)增就會發(fā)生。這時，與靶mRNA配對的siRNA小段將沿mRNA延伸，但只能延伸幾百個堿基左右就停止，并從該區(qū)裂解下來而成為次級siRNA。這種效應(yīng)稱之為“可遷移效應(yīng)”。

siRNA與靶mRNA的穩(wěn)定化與“可遷移效應(yīng)”的結(jié)合就形成了一個“連式反應(yīng)”，在這個反應(yīng)中，隨著Dicer的作用，primersiRNA的更新，以及新的一輪擴(kuò)增，將發(fā)生siRNA的多輪的復(fù)制。

應(yīng)該注意到，這種復(fù)制或擴(kuò)增并不是自我復(fù)制/擴(kuò)增，而是從primerA產(chǎn)生primerB,primerC,primerD,…這是從一個局部延伸為全體，再從全體裂解為若干局部的過程。7.2.3RNAi的遺傳

它們是一些專與某一基因特異結(jié)合的片段，而且在它們應(yīng)該發(fā)揮作用的特異的時空中，含量相當(dāng)豐富，暗示著它們也許能夠復(fù)制。Grishok等在線蟲中的實驗證明，RNAi性狀是后生的，可遺傳。它不需要通過基因序列的改變-----突變。線蟲（C.elegant）實驗(圖10)：

1）注射dsRNA;

2）把蟲子泡在含有dsRNA溶液中；

3）或者喂以正在表達(dá)有義及反義RNA的微生物。將dsRNA注射到線蟲兩性體，在子一代（F1）產(chǎn)生的基因沉默（RNAi）往往在F2消失。但是，在母性生殖系中，由RNAi引起的基因抑制，可以偶爾地遺傳到F2及以后各代中（圖7.8）。

Grishok等證明，如果RNAi在母體啟動，它可以通過F1的精子傳到F2，盡管該精子缺乏RNAi的靶基因。所以，RNAi一旦啟動，即使在缺乏內(nèi)源靶基因的情況下,雄性生殖系細(xì)胞能夠傳遞RNAi。

因此，RNAi性狀是后生的，可遺傳的。它并不需要通過基因序列的改變----突變。7.3RNAi對基因表達(dá)的作用7.3.1RNAi是對基因組的基因表達(dá)的反饋RNAi的發(fā)現(xiàn)使我們對RNA調(diào)控基因認(rèn)識不斷深入。這種小的RNAs分子根據(jù)它們的來源不同被稱為siRNA（shortinterferingRNAs）miRNA(microRNAs)。它們借助于互補的mRNA的結(jié)合，觸發(fā)mRNA降解或阻止mRNA翻譯成蛋白質(zhì)。近年來研究表明，RNAi的途徑不僅限于作用于基因組或使mRNA沉默。

在裂殖酵母中，RNAi是裝配著絲點和使配對區(qū)異染色質(zhì)化所必需的。并發(fā)現(xiàn)常染色質(zhì)可因RNAi的作用而形成異染色質(zhì)。另外，他們還發(fā)現(xiàn)，在特異的沉默機(jī)制下，在有性周期中可使用分散的內(nèi)源DNA重復(fù)序列來抑制基因。（7.9）

現(xiàn)在已經(jīng)證明，RNA從基因組上轉(zhuǎn)錄下來后能夠反饋回去修飾基因組。這些修飾作用可以通過細(xì)胞分裂遺傳下去并影響發(fā)育過程。7.3.2RNAi引導(dǎo)的同源RNA降解在動物、植物及真菌等各種生物中引起轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）/RNAi的機(jī)制都是大同小異，高度保守的。說明它的古老起源。

基本機(jī)制是dsRNA被加工成更小的片段（siRNA），對同源mRNA進(jìn)行識別與裂解，以及誘導(dǎo)DNA的甲基化而導(dǎo)致PTGS/RNAi現(xiàn)象。dsRNA的產(chǎn)生有多種方式包括：

反向的DNA重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄；有義及反義RNA的同時合成；

病毒復(fù)制，細(xì)胞/病毒的RNA依賴的RNA多聚酶（cRdRP/vRdRP）對單鏈RNA模板的轉(zhuǎn)錄。（圖7.11）PTGS/RNAi產(chǎn)生的機(jī)制可分二步：第一步是dsRNA內(nèi)切酶的作用，把sRNA加工成21~25nt的有義和反義的RNA(siRNA)，這些siRNA首先在植物中發(fā)現(xiàn)。在果蠅中，它們是由一種稱為Dicer的RNaseⅢ所產(chǎn)生。Dicer已在線蟲、S.pombe及哺乳動物中發(fā)現(xiàn)，它含有螺旋酶（helicase）,dsRNA結(jié)合域，及PAZ結(jié)構(gòu)域。第二步因Dicer所產(chǎn)生的siRNA引導(dǎo)RISC裂解同源的單鏈mRNAs。RISC恰在反義siRNA與mRNA結(jié)合區(qū)域的中間切割mRNA,使mRNA進(jìn)一步降解。

雖然RISC的大多數(shù)蛋白成分還不清楚，但已知到它含有內(nèi)切酶、外切酶、螺旋酶及同源搜索活性。RISC的成分是PAZ/Piwi蛋白。通過PAZ域與Dicer作用把siRNA吸收到RISC中。評論：PTGS/RNAi現(xiàn)象的本質(zhì)是不能正確地表達(dá)基因產(chǎn)物對基因的反饋調(diào)控。既然該基因已不能表達(dá)信息，就應(yīng)該使其沉默。這種沉默不是DNA本身的突變，而是后生的基因沉默。這種后生的DNA甲基化是遺傳的。這是一種對基因表達(dá)環(huán)境的一種可遺傳的適應(yīng)。7.3.3RNAi引導(dǎo)的同源DNA修飾RNA引導(dǎo)的同源DNA序列的胞嘧啶的從頭甲基化是首次在類病毒感染轉(zhuǎn)基因植物中發(fā)現(xiàn)的。繼之，又在非病原的植物系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)。

RNA指導(dǎo)的DNA甲基化如同降解同源RNA一樣，需要把dsR