第七章 干細胞研究及其應(yīng)用

第七章干細胞研究及其應(yīng)用山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1

InearlyOctober,aColoradocouplehasababynamedAdam,whoseumbilicalcordstemcellscouldcurehissix-year-oldsisterMolly'sFanconianemia.2000年十月發(fā)生在美國Colorado的一個故事23Onecellisremovedfromaneight-cellembryoinpreparationforpreimplantationgeneticdiagnosis.4TwoseparatedblastomeressubjectedtoFISHanalysistocheckthechromosomes5GeneticabnormalitiesdetectedwithVysisInc.'sMultiVysionPGTtechnology.6一、干細胞的概念干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞。7干細胞研究成為繼人類基因組大規(guī)模測序之后最具活力、最有影響和最有應(yīng)用前景的生命學(xué)科研究領(lǐng)域，1999年干細胞研究被美國《科學(xué)》雜志評為1999年度世界十大科學(xué)之冠，2000年干細胞研究再次被《科學(xué)》雜志評為該年度世界十大科學(xué)成就之一。

組織工程是以干細胞研究為基礎(chǔ)發(fā)展起來，它有望解決臨床上急需的人工組織與器官問題，進展極為迅速，已經(jīng)成為干細胞應(yīng)用的主要方向。8干細胞有幾個主要特征干細胞本身不是終末分化細胞；干細胞能無限增殖分裂；干細胞可連續(xù)分裂幾代，也可在較長時間內(nèi)處于靜止?fàn)顟B(tài)；干細胞分裂產(chǎn)生的子細胞只能有兩種命運——保持為干細胞或分化為特定細胞。910Alternativemodelsforstemcelldevelopment.(A)Invariantasym-metry.Astemcell(S)givesrisebyasymmetricdivisiontoaprog-enitor(P)withamorerestrictedproliferationpotential,whichdifferentiatesinresponsetoextri-nsiccues.Thestemcellphenotypeisregulatedbyreciprocalshort-and/orlong-rangesignaling(thickcoloredarrows).(B)Populationalasymmetry.Stemcellsgiverisetodaughtercellsthatcanbeeitherstemcellsorelseprogenitorsthatdifferentiatealongdifferentpathways(1,2,and3)dependingonthecombinationofextrinsicfactorstowhichtheyareexposed.ECM,extracellularmatrix.1112131981年Evans和Kaufrnan及Martin首次由小鼠中分離得到鼠的胚胎干細胞。至今已分離得到的胚胎干細胞物種有：金黃地鼠（1988）、貂（1993）、豬（1994，1997）、雞（1996）、恒河猴（1995）、絨猴（1996）。分離得到人的胚胎干細胞（1998），分離得到人的胚胎生殖細胞（1998），目前不斷報道成年組織來源的的干細胞。14二、干細胞的分類按分化潛能大小來分類:全能干細胞（Totipotentstemcell

）：它具有形成完整個體的分化潛能。如受精卵，胚胎干細胞。多能干細胞（pluripotentstemcell

），具有分化出多種組織細胞的潛能，但卻失去了發(fā)育成完整個體的能力，發(fā)育潛能受到一定的限制。如骨髓多能造血干細胞是典型的例子，它可分化出至少十二種血細胞

。專能干細胞（multipotentstemcell

），這類干細胞只能向一種類型或密切相關(guān)的兩種類型的細胞分化，如上皮組織基底層干細胞、肌肉中的成肌細胞等。15根據(jù)來源來分:來源于胚胎---胚胎干細胞ESC（EmbryonicStemCell）胚胎性生殖細胞EGC（EmbryonicGermCell）來源于成體---成體組織來源的干細胞ASC（Adult-derivedStemCell）16根據(jù)干細胞組織發(fā)生的名稱進行分類:胎胎干細胞造血干細胞骨髓間質(zhì)干細胞肌肉干細胞成骨干細胞內(nèi)胚層干細胞視網(wǎng)膜干細胞胰腺干細胞17三、胚胎干細胞181998年美國有兩個小組分別培養(yǎng)出了人多能(pluripotent)干細胞：JamesA.Thomson在Wisconsin大學(xué)領(lǐng)導(dǎo)一個研究小組從人胚胎組織中培養(yǎng)出了干細胞株。他們使用的方法是：人卵體外受精后，將胚胎培育到囊胚階段，提取innercellmass細胞，建立細胞株。經(jīng)測試這些細胞株的細胞表面marker和酶活性，證實它們就是胚胎干細胞。用這種方法，每個胚胎可取得15－20個細胞用于培養(yǎng)。JohnD.Gearhart在JohnsHopkins大學(xué)領(lǐng)導(dǎo)另一個研究小組也從人胚胎組織中建立了干細胞株。他們的方法是：從受精后5－9周人工流產(chǎn)的胚胎中提取生殖母細胞(primordialgermcell)。由此培養(yǎng)的細胞株，證實具有全能干細胞的特征。

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InduceddifferentiationofhumanES-derivedcellsinculture.21ES細胞的體外培養(yǎng)（取自干細胞和發(fā)育生物學(xué)，葉鑫生等編，2000.4）22Pluripotentmurineembryonicgermcellsidentifiedbyredstaining23Aphasecontrastimageofthepluripotentmurineembryonicgermcell24Aculturedishcontaininghundredsofcoloniesofmurineembryonicgermcells.Eachred-stainedspotrepresentsanindividualcolonycomprisedofhundredsorthousandsofstemcells.251.ES細胞的全能性主要體現(xiàn)在以下幾方面：①形成畸胎瘤。將ES細胞注人同源動物皮下可形成畸胎瘤，包括三個胚層細胞；②形成類胚體。培養(yǎng)ES細胞在非粘附底物中懸浮生長，或控制增殖細胞數(shù)目。能夠使之生成類胚體，它是一個與畸胎瘤相似的多種系混雜的集合體、具有三個胚層組織；③直系分化。通過控制ES細胞生長環(huán)境，或遺傳操縱特定基因表達，ES細胞可直接分化成某特定種系細胞，例如將神經(jīng)決定基因NeuroD2和NeuroD3轉(zhuǎn)人ES細胞，可使之分化為神經(jīng)細胞；④形成嵌合體。將ES細胞注射到同種動物囊胚腔中后，可以形成嵌合體（chimera），ES細胞可以參與嵌合體各個器官包括生殖腺的發(fā)育。這是檢驗一個細胞系是否為ES細胞的標(biāo)準(zhǔn)。262.ES細胞生物學(xué)特性細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及核型細胞的高度分化潛能堿性磷酸酶的表達胚胎階段特異性細胞表面抗原的表達27

ES細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及核型

1.各種動物的ES細胞具有與早期胚胎細胞相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，胞體體積小，核大，有一個或幾個核仁。

2.ES細胞與卵圓柱期（eggcylinderstage）胚胎外胚層和胎兒生殖峙的原始生殖細胞類似，而與ICM細胞有差異。

3.細胞中多為常染色質(zhì)，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)簡單，散布著大量核糖體和線粒體，核型正常，保留了整倍體性質(zhì)。正常ES細胞染色體正常，如發(fā)生異常則其很難發(fā)育分化形成動物個體。

4.ES細胞在體外分化抑制培養(yǎng)中，呈克隆狀生長，細胞緊密地聚集在一起，形似鳥巢，細胞界限不清，克隆周圍有時可見單個ES細胞和分化的扁平狀上皮細胞。5.ES細胞增殖迅速，每18—24h分裂增殖1次。

6.此外，其還可以在體外進行選擇、操作、凍存。凍存的細胞可在需要時隨時解凍，繼續(xù)培養(yǎng)不失其原有特性，并且來自一個克隆的細胞具有同樣的特征。28

ES細胞的高度分化潛能

ES細胞的全能性是其區(qū)別于成纖維細胞等體細胞的顯著特點1.ES細胞在體外需在飼養(yǎng)層細胞上培養(yǎng)才能維持其未分化狀態(tài)，一旦脫離飼養(yǎng)層就自發(fā)地進行分化。2.在單層培養(yǎng)時細胞自發(fā)分化成多種細胞，懸浮培養(yǎng)中：“簡單類胚體”

“囊狀胚體”

細胞分化物。3.ES細胞可進行誘導(dǎo)分化*用RA（維生素A酸或視黃酸）作誘導(dǎo)90％以上的ES細胞分化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞，*聚集培養(yǎng)的ES細胞誘導(dǎo)分化則可分化為有節(jié)律性收縮的心肌細胞。*將ES細胞注射到同源動物皮下，可形成組織瘤，其細胞組成可代表3個胚層細胞。*用ES細胞作核供體進行細胞核移植，可以得到可發(fā)育重構(gòu)胚和動物個體。29

堿性磷酸酶的表達

許多資料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚細胞和囊胚細胞均有堿性磷酸酶（AKP）表達，小鼠的EC細胞和ES細胞中均含有豐富的AKP。而在已分化的EC細胞和ES細胞中AKP呈弱陽性或陰性。豬、兔的桑椹胚和早期囊胚AKP呈陽性。因此，AKP常用來作為鑒定EC細胞或ES細胞分化與否的標(biāo)志之一。30胚胎階段特異性細胞表面抗原的表達

早期胚胎細胞表面均表達胚胎階段特異性表面抗原（SSEA－1）。在胚胎的原始外胚層細胞、ES細胞、EC細胞和原始生殖細胞的表面均可檢測到SSEA－1的表達。小鼠SSEA－1的表達自8一細胞期開始，直到原始外胚層形成期。早期囊胚ICM細胞全部呈強陽性，晚期囊胚中部分ICM呈強陽性，部分呈弱陽性，少部分為陰性。因此，SSEA也常作為ES細胞鑒定的一個標(biāo)志。313.ES細胞的鑒定--細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)--核型分析--堿性磷酸酶（AKP）染色--SSEA-I免疫熒光標(biāo)記--分化能力檢測體外分化試驗體內(nèi)分化試驗嵌合體形成試驗核移植試驗32

ES細胞形態(tài)學(xué)鑒定

依ES細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)（胞體體積小，核大、有一個或幾個核仁）和生長特性（呈克隆狀生長，細胞緊密聚集，形似鳥巢，界限不清）對ES細胞進行初步鑒定。33核型分析

ES細胞具有正常二倍體核型，可用核型分析進行檢驗34

堿性磷酸酶（AKP）染色

*常用快綠（FastGreenStaining)染色法，

*對照以已建系ES細胞（或小鼠的脫帶桑椹胚或囊胚）作為陽性對照，

*作用液中不含α-萘酚磷酸鈉為陰性對照。

*結(jié)果判定陽性對照ES細胞染成棕色，陰性對照無色。小鼠3．5日齡胚胎ICM為強陽性。

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SSEA-I免疫熒光標(biāo)記

第1抗體，SSEA－1（鼠抗ES細胞單克隆抗體），1:100稀釋；第2抗體，羊抗鼠1：10稀釋;封閉液，羊抗兔lgG。步驟①杜氏PBS洗3次,2％Triton作用20min；②再以杜氏PBS洗3次,封閉液中置20min；③以杜氏PBS洗3次，加第1抗體于4℃過液；④以杜氏PBS洗3次，加第2抗體于30℃溫箱置30min；⑤再以杜氏PBS洗3次后用甘油PBS封片。樣本在激光共聚焦圖像系統(tǒng)下觀察,結(jié)果依細胞是否出現(xiàn)熒光作出判斷。36

分化能力檢測體外分化試驗體內(nèi)分化試驗嵌合體形成核移植374.胚胎干細胞的制備1.直接由動物體內(nèi)獲取囊胚再分離ICM的方法，這樣得到的囊胚數(shù)量少，質(zhì)量也可能不高，由此會影響分離ES細胞的效率。2.卵細胞去核培養(yǎng)、轉(zhuǎn)入體細胞核，體外培養(yǎng)，獲得高質(zhì)量的去透明帶囊胚，由此囊胚進一步分離得到胚胎干細胞。383940目前已證明，小鼠、兔、羊。豬、牛等多種動物的桑椹胚以前以及囊胚的ICM細胞具有發(fā)育的全能性，因此桑胚胚或囊胚成為分離ES細胞的常用材料。ES細胞的分離早期胚胎的獲取及處理方法原始生殖細胞的獲取分化抑制物的選擇,包括：飼養(yǎng)層（feederlopr），條件培養(yǎng)基（conditionedmedium，CM）和分化抑制因子（differentiationinhibitoryactivity，DIA）基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇添加物的選用41胚胎干細胞（embryonicstemcell，ES細胞）也可被稱為多能干細胞（pluripotentstemcell，PSC），是胚胎或原始生殖細胞經(jīng)體外抑制分化培養(yǎng)后篩選出的具有發(fā)育全能性的細胞。其可以定向誘導(dǎo)分化為幾乎所有種類的細胞，甚至形成復(fù)雜的組織和器官，其建系、體外擴增、定向誘導(dǎo)分化、調(diào)控機制、細胞性能、組織重構(gòu)等方面的研究將在未來的人體發(fā)育、基因功能、藥物開發(fā)、細胞治療和組織器官替代治療中發(fā)揮重要作用，并成為組織器官移植的新資源5.目前胚胎干細胞的研究42ES細胞的應(yīng)用前景及面臨的難題

1．ES細胞的應(yīng)用前景（1）ES細胞在動物克隆及人類治療性克隆中的應(yīng)用（2）在轉(zhuǎn)基因動物中的應(yīng)用（3）制備嵌合體動物432．ES研究面臨的難題（1）體外培養(yǎng)ES細胞應(yīng)當(dāng)是既能快速無限增殖，又呈未分化狀態(tài)。如何平衡這一對矛盾,必須篩選適宜的培養(yǎng)條件。目前在ES細胞研究中存在著建系成功率也不高等問題,只在小鼠中建立了穩(wěn)定的ES細胞系，家畜、人類細胞系建立的最佳條件仍無定論。44（2）ES細胞高度未分化,具有形成畸胎瘤的可能性,因此在使用ES細胞進行治療前必須首先體外誘導(dǎo)ES細胞分化產(chǎn)生某種特異的組織細胞或設(shè)計自殺基因,當(dāng)移植的細胞向腫瘤發(fā)展時,自殺基因能啟動自毀機制使其凋亡。但如何誘導(dǎo)ES細胞定向分化成單一類型的分化細胞,是至今仍未解決的難題。因此，必須尋找各種細胞定向誘導(dǎo)分化的條件和方法，以及不同干細胞的表面標(biāo)志和分選技術(shù)，從而得到所需要的細胞或組織。45（3）ES細胞真正用于器官克隆與移植仍需要技術(shù)上的突破，因為器官的形成是一個非常復(fù)雜的三維過程,很多器官是兩個不同胚層的組織相互作用而形成的。即便是發(fā)育完整的來自自然機體的器官,要離體培養(yǎng)并維持其正常的生理功能目前還無法做到,器官的體外保存和維持仍是器官移植中的難題。46（4）最大的障礙來自于倫理學(xué)問題，特別是ES細胞應(yīng)用受到倫理、法律、宗教以及社會因素的強烈反對，有些國家甚至明令禁止進行人類ES細胞研究。無論從基礎(chǔ)研究角度來講還是從臨床應(yīng)用方面來看，人類ES細胞帶給人類的益處遠遠大于在倫理方面可能造成的負面影響，但隨著觀念的改變，人們會逐漸認識到ES細胞對臨床醫(yī)學(xué)及生物學(xué)理論研究的重要作用。47四、成體干細胞48

目前研究的成體干細胞（AdultStemCells）BoneMarrowHeamatopoieticStemCells(HSC)PeripheralBloodStemCells(PBSC)FetalLiverStemCellsUmbilicalCordBloodStemCellsNeuralStemCells

“Studiessuggestthatstemcellsindifferentad