《大學(xué)化學(xué)教學(xué)》12 分光光度法

儀器

可見(jiàn)分光光度計(jì)1整理課件2整理課件

第十二章可見(jiàn)分光光度法和

分光光度法是根據(jù)物質(zhì)的吸收光譜及光的吸收定律，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析的一種分析方法。分光光度法可見(jiàn)分光光度法（380-780nm）紫外分光光度法（10-380nm）（常用200-380nm）紅外分光光度法（780nm-3

105nm）重要特點(diǎn)：靈敏度高，適用于微量和痕量分析。相對(duì)誤差一般為2%—5%。紫外分光光度法3整理課件教學(xué)要求1.了解分光光度法的特點(diǎn)、原理和基本概念。

2.掌握Lambert-Beer定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式，能熟練利用該式進(jìn)行有關(guān)計(jì)算。3.了解分光光度法測(cè)定條件的選擇。4.了解分光光度法的誤差來(lái)源。5.掌握吸收曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法及其應(yīng)用。6.掌握分光光度法的有關(guān)應(yīng)用。7.熟悉分光光度計(jì)的主要組成部件及其作用。4整理課件§12.1物質(zhì)的吸收光譜一、物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收

當(dāng)一束光照射到某物質(zhì)或某溶液時(shí)，組成該物質(zhì)的分子、原子或離子等粒子接受光的能量，使這些粒子中的電子由低能量的軌道躍遷到高能量軌道，也就是說(shuō)：由基態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)。M（基態(tài)）+hνM*（激發(fā)態(tài)）這個(gè)過(guò)程就是物質(zhì)對(duì)光的吸收。

由于分子、離子或原子的能級(jí)是量子化的，只有光子的能量（hν）與被照射物質(zhì)粒子的基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量之差（ΔE）相等時(shí)，才能被吸收。5整理課件單色光復(fù)合光光的互補(bǔ)單一波長(zhǎng)的光由不同波長(zhǎng)的光組合而成的光若兩種不同顏色的單色光按一定的強(qiáng)度比例混合得到白光，那么就稱這兩種單色光為互補(bǔ)色光，這種現(xiàn)象稱為光的互補(bǔ)。藍(lán)黃紫紅綠紫黃綠綠藍(lán)橙紅藍(lán)綠單色光、復(fù)合光、光的互補(bǔ)6整理課件完全吸收完全透過(guò)吸收黃色光光譜示意物質(zhì)的顏色與光的關(guān)系表觀現(xiàn)象示意復(fù)合光物質(zhì)對(duì)光的吸收7整理課件二、物質(zhì)的吸收光譜測(cè)量該溶液對(duì)不同波長(zhǎng)(λ)的單色光的吸收程度，即吸光度A（absorbance）。

以波長(zhǎng)λ為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)作圖，可得一條曲線，即為吸收光譜或稱為吸收曲線。不同波長(zhǎng)(λ)的單色光依次通過(guò)有色溶液波長(zhǎng)λ1λ2λ3λ4吸光度A1A2A3A4圖12-2三（鄰二氮菲）合鐵（）離子的吸收光譜8整理課件

吸收光譜中，吸光度最大處的波長(zhǎng)為最大吸收波長(zhǎng)，用“

λmax

”表示。

若在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，靈敏度最高。λmax是定性分析的依據(jù)；而溶液的濃度越大，吸光度A越大，是進(jìn)行定量分析的依據(jù)。

圖中λmax為508nm，說(shuō)明溶液最容易吸收的波長(zhǎng)為508nm附近的光（綠色），所以溶液呈現(xiàn)綠色光的補(bǔ)色-紫紅色。9整理課件§12-2分光光度法基本原理一、透光率和吸光度均勻的有色溶液?jiǎn)紊釯oIaItIr為反射光強(qiáng)度I0=Ia+It+Ir空白溶液被測(cè)溶液I0=Ia+It

加空白消除影響，上式可簡(jiǎn)化為：Io為入射光強(qiáng)度Ia為吸收光強(qiáng)度It為透過(guò)光強(qiáng)度10整理課件

透射光的強(qiáng)度It與入射光的強(qiáng)度I0之比稱為透光率（transmittance）用符號(hào)“T”表示T

越大，溶液對(duì)光的吸收就越少；T

越小，溶液對(duì)光的吸收就越多。透光率的負(fù)對(duì)數(shù)稱為吸光度，用符號(hào)“A”表示。A越大，溶液對(duì)光的吸收就越多。11整理課件二、Lambert-Beer定律

Lambert定律：當(dāng)一適當(dāng)波長(zhǎng)的單色光通過(guò)一固定濃度的溶液時(shí)，其吸光度與液層厚度成正比。A=k1b式中：b為液層厚度；

k1為比例系數(shù)。

Beer定律：當(dāng)一適當(dāng)波長(zhǎng)的單色光通過(guò)一液層厚度固定的溶液時(shí)，其吸光度與溶液的濃度成正比。A=k2c式中：C為物質(zhì)的量濃度或質(zhì)量濃度；k2為比例系數(shù)。12整理課件將以上兩式合并得：A=εbc（Lambert-Beer定律數(shù)學(xué)表達(dá)式）

式中：b的單位為cm；c為物質(zhì)的量濃度（mol/L）；

ε為摩爾吸光系數(shù)，單位為L(zhǎng)·mol-1·cm-1。

若用質(zhì)量濃度（g·L-1）代替物質(zhì)的量濃度c，Lambert-Beer定律可表示為：A=ab

式中：a為質(zhì)量吸光系數(shù)，單位為L(zhǎng)·g-1·cm-1。a和ε可以相互換算：εbc=ab

εc=a

ε=a×/c=aM13整理課件

比吸光系數(shù)：是指100mL溶液中含被測(cè)物質(zhì)1g，液層厚度b為1cm時(shí)的吸光系數(shù)值，用表示。

如果溶液中同時(shí)存在兩種或兩種以上對(duì)光有吸收的物質(zhì)，在同一波長(zhǎng)下只要共存物質(zhì)不相互影響，也就是說(shuō)，不因共存物的存在而改變本身的吸光系數(shù)，則總吸光度是各共存物的吸光度之和。A=Aa+Ab+Ac+····14整理課件

例12-1已知某化合物的相對(duì)分子質(zhì)量為251，將此化合物用乙醇作溶劑配成濃度為0.150mmol/L的溶液，在480nm波長(zhǎng)處用2.00cm吸收池，測(cè)得透光率為39.8%，求該化合物在上述條件下的摩爾吸光系數(shù)ε及質(zhì)量吸光系數(shù)a。解：有Lambert-Beer定律可得：已知：c=0.150×10-3mol/L，b=2.00cm，T=0.39815整理課件例12-2測(cè)試酶與腺苷酸（AMP）體系的吸光度如下：

A（280nm）

=0.46，A（260nm）=0.58

試計(jì)算每一組分的濃度？已知：酶的ε（280nm）=2.96×104L·mol-1·cm-1ε（260nm）=1.52×104L·mol-1·cm-1AMP的ε（280nm）=2.4×103L·mol-1·cm-1ε（260nm）=1.5×104L·mol-1·cm-1吸收池厚度為1.00cm。16整理課件

解：設(shè)酶和腺苷酸（AMP）的濃度分別為y和z，因吸收光的加和性λ為260nm0.58=1.52×104L·mol-1·cm-1×1.00cm×y+1.5×104L·mol-1·cm-1×1.00cm×zλ為280nm0.46=2.96×104L·mol-1·cm-1×1.00cm×y+2.4×103L·mol-1·cm-1×1.00cm×z解方程組得：y=1.4×105mol/L；（酶的濃度）

z=2.5×105mol/L（AMP的濃度）17整理課件0.575光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示光譜法儀器——分光光度計(jì)基本組成部分：輻射源/光源(source)單色器(monochromator)檢測(cè)器(detector)§12.3可見(jiàn)分光光度法18整理課件標(biāo)準(zhǔn)曲線法(校準(zhǔn)曲線，工作曲線法，外標(biāo)法）01.02.03.04.0c(mg/mL)A。。。。*0.800.600.400.200.00Axcx標(biāo)準(zhǔn)系列未知樣品二、測(cè)定方法19整理課件標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法未知樣品標(biāo)準(zhǔn)樣品20整理課件（三）比吸光系數(shù)比較法

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