流式細(xì)胞儀應(yīng)用

TheApplicationsofFlowCytometry內(nèi)容流式細(xì)胞儀基本原理、應(yīng)用流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,簡(jiǎn)稱FCM）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且同時(shí)檢測(cè)單個(gè)微粒（通常是細(xì)胞）的多項(xiàng)特性的技術(shù)，同時(shí)可以對(duì)特定群體加以分選研究對(duì)象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、染色體、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量通過流式細(xì)胞儀我們可以得到以下信息

-相對(duì)細(xì)胞大小

-相對(duì)細(xì)胞顆粒密度和內(nèi)部復(fù)雜度

-染色過細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度

流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用

細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞顆粒度細(xì)胞表面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量……

細(xì)胞功能細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原細(xì)胞活性細(xì)胞內(nèi)/外的細(xì)胞因子激素結(jié)合位點(diǎn)、細(xì)胞受體蛋白磷酸化pH值鈣離子濃度細(xì)胞膜電位、線粒體膜電位

……流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)示意圖液流系統(tǒng)光路系統(tǒng)電子系統(tǒng)數(shù)據(jù)系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng)光信號(hào)如何收集？光學(xué)收集器是由若干組透鏡、濾光片、小孔組成，可將產(chǎn)生的不同波長(zhǎng)光信號(hào)引導(dǎo)至不同的電子探測(cè)器。直接染色FluorescentprobeattachedtoantibodySpecificsignal:weakNonspecificbinding:low間接染色Fluorescentprobeattachedtoa2ndantibodySpecificsignal:strong,5-62ndAb/each1stAb;Nonspecificbinding:high光學(xué)濾片分光器光電探測(cè)器信號(hào)名稱激發(fā)波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)FCSSSCFL1FL2FL3FL4FITCPEPerPCAPC側(cè)向前向488488488488488633525575667660488488(FACSCalibur型

)光路系統(tǒng)流式細(xì)胞儀的光信號(hào)散射光信號(hào)熒光信號(hào)散射光信號(hào)前向角散射光（FSC,ForwardScatter）入射激光的同向散射光信號(hào)

細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積。側(cè)向角散射（SSC,SideScatter）

入射激光90

角的散射光信號(hào)

細(xì)胞粒度及細(xì)胞內(nèi)相對(duì)復(fù)雜性。前向角散射光——FSCFALS

SensorLaser側(cè)向角散射光——SSCFALSSensor90LSSensorLaser散射光散射光能被用來區(qū)分不同細(xì)胞群體的基本形態(tài)上的差異

- 通常使用“散點(diǎn)圖”來看散射光信號(hào)

- 散點(diǎn)圖上的一個(gè)點(diǎn)就代表一個(gè)細(xì)胞顆粒的數(shù)據(jù)散點(diǎn)圖——DotPlotReviewQuestionDeadcellsareknowntobesmallerandtoexhibitmoreinternalcomplexitythanlivecells.Whichofthepopulationsonthisplotwouldyouexpecttobedead?AB熒光信號(hào)熒光素吸收激光能量熒光素將吸收能量釋放，轉(zhuǎn)換為振動(dòng)能和熱能，釋放較入射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光量子熒光素與特異抗體結(jié)合熒光抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生的熒光信號(hào)越強(qiáng) 流式圖片如何解讀？單參數(shù)直方圖雙參數(shù)散點(diǎn)圖三維圖坐標(biāo)類型：線性放大坐標(biāo)，對(duì)數(shù)放大坐標(biāo)流式圖片如何解讀？單參數(shù)直方圖橫軸表示熒光通道?？v軸表示在該通道內(nèi)收集到的細(xì)胞數(shù)量2倍體異倍體4倍體腫瘤組織中的各種DNA倍體雙參數(shù)二維點(diǎn)圖三維圖Pseudo3DPlot3DPlot流式得到的數(shù)據(jù)如何分析？BDCalibur:cellquest軟件BDcantoII，Aria,LSR：DIVA軟件不同品牌，不同類型流式細(xì)胞儀使用的分析軟件不同。流式細(xì)胞儀同一數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)為FSC文件（國(guó)際流式協(xié)會(huì)制定）由斯坦福大學(xué)設(shè)計(jì)研發(fā)的一款非常強(qiáng)大的流式數(shù)據(jù)分析軟件---------FlowJo軟件陰性對(duì)照組和CD3FITC/CD19PE雙染樣本散點(diǎn)圖象限界定下圖劃分為四個(gè)象限，以區(qū)分陰性細(xì)胞、單陽(yáng)性細(xì)胞以及雙陽(yáng)性細(xì)胞。左下象限（LL）為雙陰性細(xì)胞，左上象限（UL）為Y軸陽(yáng)性細(xì)胞（CD19PE），右下象限（LR）為X軸陽(yáng)性細(xì)胞（CD3FITC），右上象限（UR）為雙陽(yáng)性細(xì)胞（CD19+/CD3+）。流式得到的數(shù)據(jù)如何分析？流式得到的數(shù)據(jù)如何分析？有熒光標(biāo)記的細(xì)胞與無熒光標(biāo)記的區(qū)分開來流式得到的數(shù)據(jù)如何分析？高FL細(xì)胞與低FL細(xì)胞區(qū)分開來這些分析方法通常適用于計(jì)算離散細(xì)胞群的百分含量，對(duì)于分析單克隆細(xì)胞株分子是否呈陽(yáng)性并不適用。因?yàn)閱慰寺〖?xì)胞株是單個(gè)細(xì)胞群，在大多數(shù)情況下，既不是100%陰性，也不是100%陽(yáng)性，所以我們通過幾何均值法和中位法統(tǒng)計(jì)細(xì)胞熒光密度和陽(yáng)性率。如果樣本的統(tǒng)計(jì)結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于陰性對(duì)照組，那么我們認(rèn)為其結(jié)果是陽(yáng)性的，兩者間的差異越大，說明細(xì)胞的表達(dá)越高，陽(yáng)性率越高流式幾個(gè)重要概念門：用于分析樣本內(nèi)的指定細(xì)胞同型對(duì)照

------除去熒光抗體的特異性決定位點(diǎn)，是真正意思上的陰性對(duì)照是使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性與細(xì)胞結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色

流式幾個(gè)重要概念例：一個(gè)雙色染色的實(shí)驗(yàn)抗體AFITC，抗體BPE

對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照是IgG1FITC,IgG1PE那么需要準(zhǔn)備的是陰性對(duì)照：細(xì)胞加上IgG1FITC,IgG1PE單陽(yáng)性對(duì)照：

FITC:細(xì)胞加上AbAFITC,IgG1PEPE:細(xì)胞加上AbBPE,IgG1FITC流式幾個(gè)重要概念亦可在封閉是加入一抗來源的免疫球蛋白陰性對(duì)照cellonly流式幾個(gè)重要概念抗體染色一般方法外周血白細(xì)胞分析：100ul全血血小板分析：1-5ul全血（根據(jù)樣本血小板數(shù)量）紅細(xì)胞分析：1ul全血（根據(jù)樣本中紅細(xì)胞數(shù)稀釋后使用）骨髓：20ul其他樣本，計(jì)數(shù)后決定使用體積目標(biāo)細(xì)胞數(shù)量及檢測(cè)終濃度：1×106/ml孵育、溶血、固定抗體孵育：下避光20分鐘（某些情況下如：細(xì)胞內(nèi)因子檢測(cè)需冰育）固定：1%paraformaldehyde200ul重懸20min流式檢測(cè)對(duì)象要求？目標(biāo)物可以是細(xì)胞、細(xì)菌或各種微粒0.5um~50um范圍內(nèi)動(dòng)物標(biāo)本來源：外周血、骨髓、組織塊、培養(yǎng)細(xì)胞、脫落細(xì)胞及其他。以及血清或各類體液樣本。Flowcytometryofapoptoticcelldeath凋亡細(xì)胞檢測(cè)方法一凋亡細(xì)胞檢測(cè)方法一凋亡細(xì)胞檢測(cè)方法二DNA鏈的斷裂細(xì)胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶（某些Caspase的底物）在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長(zhǎng)度在180-200bp的DNA片段。斷裂的末端可以通過末端轉(zhuǎn)脫氧核苷酰酶(TdT)連接上dUTP。Br-dUTP（三磷酸溴脫氧尿苷）鏈接DNA斷裂點(diǎn)檢測(cè)凋亡凋亡細(xì)胞檢測(cè)方法二凋亡細(xì)胞檢測(cè)方法三細(xì)胞DNA含量

在凋亡細(xì)胞中，用PI染色，通過流式檢測(cè)DNA含量，可以發(fā)現(xiàn)一種亞群的細(xì)胞，其染色熒光強(qiáng)度下降。這是由于隨著調(diào)亡的進(jìn)行，核酸內(nèi)切酶活化，隨后一部分DNA泄漏出去，造成細(xì)胞內(nèi)DNA含量下降造成的。