環(huán)境微生物學(xué)中基因組學(xué)的應(yīng)用

環(huán)境微生物學(xué)中基因組學(xué)的應(yīng)用

由于地球人口的迅速增加和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的快速發(fā)展，大量有毒和有害的殘留物被釋放到土壤、水和土壤，嚴(yán)重?fù)p害了人類的棲息地。在各種環(huán)境污染的治理技術(shù)中,生物修復(fù)技術(shù)以其高效安全而備受推崇。生物修復(fù)是指利用生物吸收、轉(zhuǎn)化、清除或降解環(huán)境污染物,實現(xiàn)環(huán)境凈化、生態(tài)恢復(fù)的生物措施,其中微生物的作用與研究最受關(guān)注。自1989年Exxon公司和美國環(huán)保局成功地實施“阿拉斯加計劃”以來,微生物修復(fù)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于清除土壤、地下水、河流、湖泊和海洋等環(huán)境中的污染物,這些污染物主要包括多環(huán)芳烴(PAHs)、鹵代芳烴、鹵代烷烴、重金屬以及引起水體富營養(yǎng)化等其它成分等。但是,由于微生物修復(fù)是一個多種功能微生物協(xié)同作用,復(fù)雜而精細(xì)的生物過程,其中可能包括一些低豐度或不可培養(yǎng)的微生物的參與,因此傳統(tǒng)的生物學(xué)分析方法難以全面而深入地了解其修復(fù)機制,并實施實時監(jiān)控和評價。至今人們對環(huán)境微生物的認(rèn)識還非常有限,大量的環(huán)境微生物尚不能在實驗室中培養(yǎng)和研究,而對已分離純化的功能環(huán)境微生物的生理活性和代謝潛能的認(rèn)識也還是相當(dāng)欠缺的。在過去幾十年中,隨著分子生物學(xué)、生物信息學(xué)和相關(guān)理化檢測技術(shù)的發(fā)展,尤其是人類基因組計劃成功實施以來,基因組學(xué)研究進(jìn)展迅速,從而帶動了轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)的發(fā)展。于是人們在研究各種生命現(xiàn)象的過程如污染環(huán)境的微生物修復(fù)問題開始注重整體和全面的研究,研究思維也逐漸實現(xiàn)點面和動靜的結(jié)合。1本研究在污染環(huán)境微生物修復(fù)中的應(yīng)用1.1其他功能蛋白Mattes等測序和分析了極地單胞菌JS666的全基因(5.9Mb),該菌株在烷烴、多環(huán)芳烴降解和抗金屬污染方面具有很好的潛力。研究發(fā)現(xiàn),該菌擁有編碼烷烴、鹵代烷烴和芳香族化合物降解蛋白的基因,并經(jīng)實驗證實該菌株可以降解兒茶酚、辛烷、鹵烴和龍膽酸酯等多種有機污染物。Kim等也做了類似的工作,將能高效降解高分子量多環(huán)芳烴的分支桿菌PYR-1的全基因組進(jìn)行了測序,發(fā)現(xiàn)其6.5Mb大小的基因組可編碼194個芳烴降解的功能蛋白。Rabus等發(fā)現(xiàn)了一株能降解芳烴的厭氧反硝化細(xì)菌EbN1,其基因組大小為4.7Mb,包含一條染色體和兩個質(zhì)粒,該細(xì)菌基因組擁有十條厭氧和四條好氧的芳烴降解途徑,該研究結(jié)果使得人們對于微生物所擁有的多通路、高適應(yīng)性的芳烴降解能力有了更加深刻的認(rèn)識,同時也為將來成功地設(shè)計和應(yīng)用工程微生物修復(fù)污染環(huán)境提供有力的技術(shù)支撐。1.2微生物組織化學(xué)研究一般環(huán)境中可培養(yǎng)的微生物僅占自然界微生物總數(shù)的1%,大量微生物的不可培養(yǎng)性成為經(jīng)典微生物生態(tài)學(xué)揭示自然界微生物群落組成、結(jié)構(gòu)、生態(tài)功能及種間關(guān)系的一大障礙。自1991年P(guān)ace等。環(huán)境基因組學(xué)的方法為人們在DNA水平上了解自然微生物群落結(jié)構(gòu)和潛在功能提供了一個強有力的工具。同時,利用單基因測序(通常是16S或18S)和擴增DNA的片段分析手段對自然微生物群落結(jié)構(gòu)及其對環(huán)境壓力的響應(yīng)研究結(jié)果已向人類展示了一幅精彩的微生物畫卷。Loy等利用一個含79個16SrDNA寡核苷酸探針的DNA微矩陣(DNAmicroarray),調(diào)查了工業(yè)廢水處理的活性污泥中紅環(huán)菌目的生物多樣性,并成功監(jiān)測到了在廢水處理過程中起重要作用卻不可培養(yǎng)分離的鐵桿菌屬、動膠菌屬和脫氯單胞菌等微生物。Martin等通過對生物強化除磷(EPBR)系統(tǒng)的活性污泥構(gòu)建宏基因組文庫,發(fā)現(xiàn)不可培養(yǎng)的Candidatusphosphatis在該生物處理具有重要作用。Suenaga等通過構(gòu)建活性污泥總DNA文庫,以鄰苯二酚為底物尋找雙加氧酶活性克隆子,并獲得了91株陽性克隆,經(jīng)插入片段測序分析發(fā)現(xiàn)了新的芳烴降解雙加氧酶亞族。我課題組采用限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)的方法對一株產(chǎn)毒塔瑪亞力山大藻在不同生長時期藻際細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)所有的細(xì)菌基因型分屬2個細(xì)菌類群:變形細(xì)菌門和擬桿菌門,兩者在延滯期、指數(shù)后期和穩(wěn)定期所占比例不同,這些細(xì)菌可能在赤潮的生消過程中起著重要的調(diào)控作用。另外,課題組通過16SrDNA可變區(qū)域PCR擴增和變形梯度凝膠電泳(DGGE)分析廈門西港油碼頭表層海水樣品中高分子量多環(huán)芳烴———苯并芘的降解優(yōu)勢菌,并獲得了蒼白桿菌屬,寡養(yǎng)單胞菌屬和假單胞菌屬中的三株優(yōu)勢降解菌,將三者混合培養(yǎng)兩周后發(fā)現(xiàn)初始濃度10mg/L的苯并芘降解率達(dá)44.07%,為目前相關(guān)報道的較高水平。顯然,基因組學(xué)是尋找環(huán)境修復(fù)功能微生物、功能基因的重要方法,為揭示各種微生物修復(fù)過程中的生命現(xiàn)象提供重要的保障。但隨著研究的不斷深入,研究者發(fā)現(xiàn)微生物基因組具有均一性、完整性和穩(wěn)定性,而基因組的表達(dá)是具有時空特異性的。微生物的生命活動遵循著最低消耗需求的原則,其基因組的具體表達(dá)情況會因環(huán)境的改變而改變,這就使得人們即使獲知了微生物全基因組信息仍無法確定各基因的具體表達(dá)情況,從而阻礙人們揭示隱藏在基因組中的秘密,因此研究DNA直接的產(chǎn)物———mRNA就成為突破該瓶頸的關(guān)鍵。2轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法轉(zhuǎn)錄組學(xué)(Transcriptomics)概念是Velculescu等于1997年首先提出,指研究細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所含mRNA的類型與拷貝數(shù)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究打破了以往只對單個基因或少數(shù)幾個基因零打碎敲式的研究模式,將基因組研究帶入了一個高速發(fā)展時代。轉(zhuǎn)錄組學(xué)在功能基因鑒定、基因組表達(dá)水平的檢測及環(huán)境修復(fù)過程中微生物群落結(jié)構(gòu)和功能探討等方面有著廣泛的應(yīng)用,在整個生物修復(fù)研究中具有承上啟下的作用。Jennings等通過cDNA微矩陣(cDNAmicroarray)對極地單胞菌JS666礦化二氯乙醚的過程進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,經(jīng)cDNA與全基因表達(dá)矩陣雜交發(fā)現(xiàn)有關(guān)抗氧化、ABC轉(zhuǎn)運及Na+同向轉(zhuǎn)運的蛋白表達(dá)上調(diào)。并推測二氯乙醚的降解途徑主要包括碳原子和氯原子的斷裂及單加氧酶的環(huán)氧化作用。Kim等應(yīng)用cDNA微陣列技術(shù)檢測釀酒酵母基因組在不同環(huán)境脅迫下表達(dá)文庫的差異,以此來衡量紡織廠廢水的潛在毒性。研究表明,釀酒酵母這種基因組表達(dá)文庫差異性變化可以作為檢測環(huán)境污染物潛在毒性的指標(biāo)。隨著從古細(xì)菌、細(xì)菌和真核微生物中直接提取mRNA技術(shù)的發(fā)展使得研究者可以較快速地獲得整個微生物群落的基因轉(zhuǎn)錄譜,即宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)。宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)與基因測序或cDNA微矩陣相結(jié)合為檢測天然微生物群落轉(zhuǎn)錄活性提供了切實可行的方法。UrichT等通過宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法同時獲得了土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能的信息。在該研究中,經(jīng)總RNA提取后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,然后測序獲得了193219個確切的分類上的rRNA標(biāo)簽,其中有21133個mRNA標(biāo)簽在土壤微生物中具有功能。雖然,轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法的引入在一定程度上彌補基因組學(xué)研究方法的不足,但mRNA自身存在貯存、轉(zhuǎn)運、降解、翻譯調(diào)控,同時蛋白也存在翻譯后加工、轉(zhuǎn)運定位、功能結(jié)構(gòu)形成、蛋白與蛋白或核酸的相互作用等一系列生命活動,而這些均不能從基因組和轉(zhuǎn)錄組水平獲知。因此,為了能進(jìn)一步地探索和認(rèn)識微生物的奧秘,一門從整體水平上探討細(xì)胞蛋白質(zhì)的組成及其活動規(guī)律的新學(xué)科———蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)應(yīng)運而生。3通過蛋白質(zhì)組和宏蛋白組的理論研究凈化環(huán)境微生物的利用3.1蛋白質(zhì)組織化學(xué)蛋白質(zhì)組(Proteome)概念是澳大利亞學(xué)者Wilkins等1994年首先提出,指的是在特定的生理條件下,一個基因組、細(xì)胞或者組織表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。目前,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在污染環(huán)境的微生物修復(fù)過程中功能微生物鑒定、功能蛋白識別、生物修復(fù)環(huán)境污染物機理等方面的研究具有重要的作用。Santos等研究發(fā)現(xiàn)在苯酚培養(yǎng)壓力下會導(dǎo)致惡臭假單胞菌KT2440一系列功能蛋白表達(dá)水平的上調(diào),這些蛋白主要參與以下生命活動:應(yīng)激反應(yīng)、能量代謝、脂肪酸合成、細(xì)胞分裂抑制和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等。Kim等采用雙向電泳和質(zhì)譜聯(lián)用(2-DE/MS)分析該菌對安息香酸鹽和香草醛等芳香族化合物的降解途徑時發(fā)現(xiàn)約80種功能蛋白,其中包括雙加氧酶、水解酶、硫解酶等。Kim等采用雙向電泳技術(shù)(2-DE)研究了分支桿菌PYR-1在芘誘導(dǎo)下的蛋白譜圖,發(fā)現(xiàn)了27個芘降解途徑必需的酶蛋白,其中終端環(huán)羥基氧化酶、二氫二醇脫氫酶和環(huán)斷裂雙加氧酶是芘降解途徑所特有的,另外該研究組還根據(jù)上述結(jié)果首次闡述了一條完整的芘降解途徑。本課題組采用蛋白組學(xué)技術(shù)研究了一株篩選自海洋環(huán)境的、高效的菲降解菌———鞘氨醇單胞菌H在菲誘導(dǎo)下的表達(dá)蛋白質(zhì)組,獲得了包括加氧酶類、醛縮酶類、醛脫氫酶類、GST谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等在內(nèi)的54個菲降解的相關(guān)蛋白,并對關(guān)鍵的降解酶基因———鄰苯二酚雙加氧酶基因進(jìn)行了克隆與表達(dá),最后結(jié)合鞘氨醇單胞菌H利用菲降解的關(guān)鍵中間代謝產(chǎn)物的情況,推導(dǎo)出了該菌株降解菲的代謝途徑。另外,有關(guān)新鞘氨醇菌降解苯并芘等高分子量多環(huán)芳(HMW-PAHs)的相關(guān)功能蛋白研究也在開展,經(jīng)雙向電泳的方法發(fā)現(xiàn)了新鞘氨醇菌US6-1T在苯并芘誘導(dǎo)下的部分差異蛋白,相關(guān)的數(shù)據(jù)分析和關(guān)鍵酶的表達(dá)研究也正在開展當(dāng)中。3.2微生物蛋白質(zhì)組學(xué)研究近來,微生物研究者通過蛋白組學(xué)方法直接研究某一個生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落的全蛋白表達(dá)譜,以檢測各微生物在生態(tài)系統(tǒng)中的功能。宏蛋白組學(xué)技術(shù)目前在雙向電泳-質(zhì)譜聯(lián)用、蛋白測序及數(shù)據(jù)庫發(fā)展和完善下取得了長足的進(jìn)步。Benndorf等研究了被2,4-二氯苯乙酸(2,4-D)污染的土壤和被氯苯污染的地下水中微生物群落的宏蛋白組。該研究利用石碳酸法從腐質(zhì)泥中提取群落全蛋白,經(jīng)雙向電泳分離和LC-ESI-MS分析發(fā)現(xiàn)2,4-二氯苯乙酸雙加氧酶、氯代鄰苯二酚雙加氧酶、分子伴侶和轉(zhuǎn)錄因子在微生物利用上述兩種氯化芳香化合物中具有重要作用。Wilmes等利用雙向電泳及MALDI-TOF和(Q-TOF)MS/MS聯(lián)用分析EPBR系統(tǒng)中活性污泥中的高表達(dá)蛋白,通過與已知EPBR活性污泥全蛋白比較發(fā)現(xiàn)有46個蛋白與Candidatusphosphatis的蛋白系列相近,這也進(jìn)一步驗證了Martin等對Candidatusphosphatis在EPBR系統(tǒng)中所起的作用。從理論上,微生物蛋白質(zhì)組學(xué)研究應(yīng)包含微生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì),但是蛋白質(zhì)組學(xué)也存在諸多不足,如低豐度蛋白難以檢測和分離;極酸、極堿性和難溶性蛋白質(zhì)的分離和鑒定還比較困難;蛋白分離的穩(wěn)定性、可重復(fù)性和特異性較低等,在一定程度上限制了蛋白組學(xué)的應(yīng)用,使得單一的蛋白組學(xué)分析方法無法全面解釋某一微生物修復(fù)過程,于是人們又將目光聚焦在微生物代謝產(chǎn)物上。4代謝組學(xué)在生物樣品檢測中的應(yīng)用代謝組學(xué)(Metabolomics)的概念是Oliver在1997年首先提出的,它是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后應(yīng)運而生并得以發(fā)展起來的,同時進(jìn)行定性和定量分析某一生物或細(xì)胞在某一特定生理時期內(nèi)所有低分子量代謝產(chǎn)物(MW<1000)的一門新學(xué)科。基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分別從DNA、mRNA和蛋白質(zhì)層面探尋生命的活動,而實際上細(xì)胞內(nèi)許多生命活動是發(fā)生在代謝物層面的,如細(xì)胞信號釋放,能量傳遞,細(xì)胞間通信等都是受代謝物調(diào)控的。因此有人認(rèn)為,“基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)告訴你什么可能會發(fā)生,而代謝組學(xué)則告訴你什么確實發(fā)生了”。與轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)相比,代謝組學(xué)具有得天獨厚的優(yōu)勢:(1)基因和蛋白表達(dá)的有效的微小變化會在代謝物上得到放大,從而使檢測更容易;(2)不需要建立全基因組測序及大量表達(dá)標(biāo)簽(EST)的數(shù)據(jù)庫;(3)代謝物種類遠(yuǎn)小于基因和蛋白的數(shù)目,一般微生物的中間代謝物僅在103數(shù)量級,遠(yuǎn)低于前兩者;(4)因代謝產(chǎn)物在各種微生物中是類似的,所以代謝組學(xué)的研究技術(shù)更通用。代謝組學(xué)主要技術(shù)手段包括核磁共振光譜(NMR)、直接注射質(zhì)譜(DIMS)、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)、毛細(xì)管與質(zhì)譜聯(lián)用(CE-MS)、傅里葉紅外光譜(FI-IR)、拉曼光譜(Raman)等。Moody等采用HPLC結(jié)合紫外-可見光檢測器、質(zhì)譜等技術(shù),分析了分支桿菌PYR-1降解蒽和菲產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物,在蒽的培養(yǎng)液中得到順-1,2-二羥-1,2-二氫蒽,6,7-苯并香豆素,1-甲氧基-2-羥蒽,9,10-蒽醌等,并且根據(jù)所獲得一種新的環(huán)裂解產(chǎn)物3-(2-羧基乙烯基)-萘-2-羧酸,而發(fā)現(xiàn)了一條新的PYR-1降解蒽的途徑。Boersma等采用代謝組學(xué)方法研究氟代酚的微生物降解途徑,推測紅球菌內(nèi)羥化酶先在不同的取代位羥基化氟代酚,然后再經(jīng)兒茶酚內(nèi)位雙加氧酶開環(huán)形成氟代粘糠酸的代謝過程。Keum等研究了中華根瘤菌C4在普通營養(yǎng)條件或以菲為底物下的代謝組,發(fā)現(xiàn)在以菲為碳源的情況下,除了海藻糖、支鏈氨基酸及三羧酸循環(huán)和糖酵解途徑中的中間代謝物上升以外,其余代謝物的量均下降了,這無疑為中華根瘤菌C4降解菲的途徑的推導(dǎo)指明了方向。隨著代謝組學(xué)研究的發(fā)展,研究人員為了獲得更加直觀的代謝通路以及實現(xiàn)微生物修復(fù)的實時監(jiān)測和調(diào)控,正對動態(tài)、實時監(jiān)測細(xì)胞代謝物變化的研究給予高度關(guān)注,即代謝流(Fluxomics)。Tang等綜合運用GC-MS和統(tǒng)計學(xué)、生物化學(xué)及遺傳學(xué)等方法對一株具有重金屬轉(zhuǎn)化、核污染及鹵代化合物修復(fù)功能希瓦氏菌。在不同碳源生長條件下代謝流進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)該希瓦氏菌擁有非常靈巧的物質(zhì)代謝通路,這些研究結(jié)果表明代謝組學(xué)在生物修復(fù)研究中起著檢驗和修正的作用,在整個研究過程中具有舉足輕重的地位。雖然代謝組學(xué)的研究起步較晚,而生物的代謝