食品中大腸菌群的測定(MPN法)

實驗

食品中大腸菌群的測定(MPN法)參考GB4789．3-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)大腸菌群MPN計數(shù)法xx職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測教研室xx回顧相關(guān)知識

1、什么叫大腸菌群？食品中大腸菌群計數(shù)的衛(wèi)生學(xué)意義是什么？2、什么是大腸菌群MPN計數(shù)法？大腸菌群是指一群在一定培養(yǎng)條件下可發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌主要來源自人畜糞便，作為糞便污染指標(biāo)評價食品衛(wèi)生質(zhì)量，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。

MPN是對樣品中活菌濃度的一種估計數(shù)。采用“逐級稀釋至無菌”的方法進(jìn)行。具體做法是對樣品做連續(xù)系列稀釋，接種于裝有液體培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)，按照陽性管的管數(shù)和稀釋度，對原始樣品中的被檢菌作統(tǒng)計學(xué)估計。食品中大腸菌群數(shù)以每g（mL）樣品中大腸菌群的最可能數(shù)來表示，即為大腸菌群MPN值。一、實驗?zāi)康撵柟淌称分写竽c菌群計數(shù)的衛(wèi)生學(xué)意義掌握MPN計數(shù)法檢驗食品中大腸菌群的原理和方法MPN計數(shù)法包括初發(fā)酵試驗和復(fù)發(fā)酵試驗。初發(fā)酵試驗：利用大腸菌群能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的原理。復(fù)發(fā)酵試驗：牛膽粉和煌綠抑制非腸桿菌科細(xì)菌，再次進(jìn)行乳糖發(fā)酵試驗，經(jīng)48h培養(yǎng)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的，最終確定為大腸菌群陽性結(jié)果。二、實驗原理1、培養(yǎng)基：月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯、煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯2、儀器或其他用具：電子天平（感量0.1g）、無菌不銹鋼勺、無菌稱量紙、無菌吸管（1mL和25mL）、試管、三角瓶、無菌生理鹽水（9mL/管，225mL/三角瓶內(nèi)含適量玻璃珠）、無菌1mol/LNaOH、無菌1mol/LHCl、75%酒精棉球、廣口瓶、滅菌剪刀、滅菌鑷子、酒精燈、精密pH試紙、恒溫培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、均質(zhì)器、振蕩器、接種環(huán)等。四、實驗器材

檢樣稀釋月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）36±１℃，24~48±2h不產(chǎn)氣產(chǎn)氣煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）36±１℃，24~48±2h不產(chǎn)氣產(chǎn)氣大腸菌群陰性大腸菌群陽性報告大腸菌群檢驗程圖（新國標(biāo)MPN法）五、實驗步驟1、樣品處理：固體和半固體食品：以無菌操作取25g樣品，放入裝有225mL生理鹽水的三角瓶中，充分振蕩，制成1:10樣品勻液無菌均質(zhì)杯或無菌均質(zhì)袋內(nèi)，于8000r/min均質(zhì)1min～2min，制成1:10樣品勻液。1、樣品處理：液體食品：以無菌吸管吸取樣品25mL放入裝有225mL生理鹽水的無菌玻璃瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）中，以30cm幅度、于7s內(nèi)振搖25次（或以機械振蕩器振搖）,制成1:10的樣品勻液。2、樣品稀釋：1:1025g/ml樣品1ml1ml1ml1:1001:10001:10000生理鹽水注意：吸管尖端不要觸及稀釋液面，每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。3、初發(fā)酵試驗：

記錄在24h和48h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管數(shù)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性，產(chǎn)氣者則進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗。LST不產(chǎn)氣（-）

小導(dǎo)管里無氣泡4、復(fù)發(fā)酵試驗：

注意：以48h±2h為最終觀察結(jié)果時限。結(jié)果也以此時為最終結(jié)果。

LST產(chǎn)氣（+）將產(chǎn)氣的試管內(nèi)樣品接種到BGLB肉湯05、大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報告：根據(jù)經(jīng)確證后的大腸菌群LST

陽性管數(shù)查MPN表，報告每g（mL）樣品中大腸菌群MPN值。1g(mL)檢樣中最大可能數(shù)（MPN）表--420>1100333948.7272124,1001801100233424.5201122,00090460133423.7150121,00042240033424.5202021,00090290323423.61410243040210223381.49.200242037150123424.5160314201893023424.51512142040160313423.61102142037120213383.6111112001775113201.37.4011180943013383.6112011801764203181.37.21011108.738103180.173.6001944.623003383.69.4030948.736132181.26.2020948.729032181.26.1110948.735222110.153.0010948.7281229.60.153.0100424.5210229.5--<3.0000高低0.0010.010.10高低0.0010.010.1095%置信區(qū)間MPN陽性管數(shù)95%置信區(qū)間MPN陽性管數(shù)六、實驗結(jié)果與分析經(jīng)查MPN表，樣品中大腸菌群數(shù)為

MPN/g（mL）陽性管數(shù)0.100.010.001LST發(fā)酵管BGLB證實管分析一些主要食品衛(wèi)生指標(biāo)（微生物）

食品種類細(xì)菌個數(shù)/mL（g）大腸菌群MPN致病菌醬類、醋類＜5000＜30，醋不得檢出不得檢出腐乳類、豆豉、醬菜類＜30不得檢出豆腐干、豆腐、豆腐干＜50000＜70不得檢出涼粉＜500＜30不得檢出消毒牛乳、甜煉乳＜30000＜40不得檢出全脂奶粉＜5000＜40不得檢出瓶裝汽水、果汁飲料＜100＜5不得檢出全啤酒＜1000＜50不得檢出發(fā)酵酒（熟啤酒、黃酒