常用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞原代培養(yǎng)

細(xì)胞原代培養(yǎng)2023/10/2712023/10/2722023/10/27凡是來(lái)源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來(lái)的原初培養(yǎng)的細(xì)胞稱之為原代細(xì)胞。22023/10/2732023/10/27125一、培養(yǎng)室的無(wú)菌操作1、培養(yǎng)前準(zhǔn)備制訂實(shí)驗(yàn)計(jì)劃、操作程序、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；準(zhǔn)備：器材、物品置于超凈臺(tái)；（細(xì)胞、培養(yǎng)液）各種物品75%酒精擦拭后，再放入超凈臺(tái)。2、超凈臺(tái)消毒紫外線照射30min,細(xì)胞和培養(yǎng)液不能照射；物品排放整齊，不要過(guò)多重疊，否則效果降低；實(shí)驗(yàn)前75%酒精擦拭臺(tái)面；32023/10/2742023/10/271253、防護(hù)戴手套，75%酒精/0.2%新潔爾滅消毒手和手臂；戴口罩，不允許講話（支原體）；有條件，白大褂、帽子.4、無(wú)菌操作操作前，過(guò)酒精燈火焰消毒，冷卻后使用；瓶口、瓶蓋、移液管、膠塞、鑷子等手不能拿出超凈臺(tái)，否則重新擦拭。42023/10/2752023/10/27125臺(tái)面物品擺放有序，左手：右手，酒精燈居中；移液管/槍頭不能交叉使用；移液管等不能觸及瓶口、皿口等；瓶口傾斜，瓶蓋豎放，皿蓋半開(kāi)，防止細(xì)菌落入；吸管口向下傾斜，防止液體倒流。不能在開(kāi)啟容器上方操作。在超凈臺(tái)中央無(wú)菌區(qū)域操作。槍頭盒用后蓋上?；鹧娓浇僮?。2023/10/2762023/10/27125?取材是原代細(xì)胞培養(yǎng)成功的首要條件，直接影響細(xì)胞的體外培養(yǎng)。取材基本要求1．取材要注意新鮮，否則1cm3、4℃保存，24hr內(nèi)使用2．嚴(yán)格無(wú)菌3．防止機(jī)械損傷→鋒利刀片切割4．去除無(wú)用組織（血液、脂肪、結(jié)締、壞死組織），避免干燥5．記錄：組織類(lèi)型、分化程度、年齡等，留好樣本二、原代細(xì)胞的取材2023/10/2772023/10/276.原代培養(yǎng)，需營(yíng)養(yǎng)豐富（10%-20%胎牛血清，進(jìn)口）7.各種組織培養(yǎng)的難易程度胚胎組織較成熟個(gè)體組織易培養(yǎng)分化低的較分化高的組織易培養(yǎng)腫瘤組織較正常組織易培養(yǎng)2023/10/2782023/10/27各類(lèi)組織的取材技術(shù)皮膚和粘膜的取材內(nèi)臟和實(shí)體瘤的取材血液細(xì)胞的取材骨髓、羊水、胸/腹水細(xì)胞取材動(dòng)物組織取材人胚體組織取材雞（鴨）鳥(niǎo)類(lèi)胚胎組織取材2023/10/2792023/10/27皮膚和粘膜的取材上皮細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)源：來(lái)源：主要取自于手術(shù)過(guò)程中的皮片；消毒：體表微生物多，嚴(yán)格消毒，不能用碘酒=〉影響細(xì)胞生長(zhǎng)；面積一般2-4mm2；不要太厚，盡量去除皮下和粘膜下組織。2023/10/27102023/10/27內(nèi)臟和實(shí)體瘤的取材內(nèi)臟除消化道外基本是無(wú)菌的；明確、熟悉所需組織的類(lèi)型和部位；實(shí)體瘤：取腫瘤細(xì)胞豐富區(qū)域；要避開(kāi)破潰、壞死液化部分，以防污染；盡量去除混雜的血管、神經(jīng)和結(jié)締組織。2023/10/27112023/10/27血液細(xì)胞的取材血細(xì)胞：一般多抽取靜脈血淋巴細(xì)胞：從淋巴組織中（如脾、扁桃體、胸腺、淋巴結(jié)等）分離細(xì)胞；取材時(shí)應(yīng)抗凝（肝素）常用濃度20U/mL針筒用500U/mL肝素潤(rùn)濕。2023/10/27122023/10/27骨髓、羊水、胸/腹水細(xì)胞取材嚴(yán)格無(wú)菌；離心PBS洗兩次培養(yǎng)液洗一次，培養(yǎng)。2023/10/27132023/10/27鼠胚組織取材引頸或氣管窒息法處死孕期鼠；75%酒精浸泡5分鐘（時(shí)間不能長(zhǎng)，否則酒精從口或其他通道進(jìn)入體內(nèi)，影響組織活力）；無(wú)菌圖釘固定四肢在消毒木板上；切開(kāi)皮膚，無(wú)菌取胚或無(wú)菌止血鉗挾起皮膚、沿軀干中部環(huán)形剪開(kāi)皮膚，挾住兩側(cè)皮膚拉向頭尾，把動(dòng)物反包，暴露軀干，取出胚胎。2023/10/27142023/10/27鼠胚腎（或肺）取材幼鼠采用上述方法處死消毒后，腹部/背部朝上固定在木板上；腹部朝上，無(wú)菌打開(kāi)胸腔取肺?；虮巢砍?，無(wú)菌取腎。2023/10/27152023/10/27雞（鴨）鳥(niǎo)類(lèi)胚胎組織取材取孵化9-12天的胚蛋；燈檢有豐富血管、胚體運(yùn)動(dòng)的胚蛋，劃出氣室和胚體位置；用溫水清洗蛋殼，再用75%酒精棉球擦干；無(wú)菌打開(kāi)氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼；無(wú)菌取出雞胚。2023/10/27162023/10/27（一）懸浮細(xì)胞的分離方法組織材料：血液、羊水、胸水或腹水；方法：采用1000r/min的低速離心10分鐘。離心后各種比重不同的細(xì)胞在分層液中分層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。注意：速度不能過(guò)高，時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，以免擠壓細(xì)胞，引起損傷和死亡。三、組織材料的分離2023/10/27172023/10/27（二）實(shí)體組織材料（組織塊）的分離方法實(shí)體組織材料，細(xì)胞間結(jié)合緊密組織細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液機(jī)械分散法（物理裂解）消化分離法。2023/10/27182023/10/27機(jī)械分散法適用對(duì)象：纖維成分很少的組織腦組織、胚胎組織及一些腫瘤組織；方法:剪切后，吸管反復(fù)吸打組織通過(guò)注射器針頭---細(xì)胞損傷大。注射器芯擠壓通過(guò)不銹鋼網(wǎng)篩---常用。特點(diǎn):簡(jiǎn)便、快速對(duì)組織機(jī)械損傷大細(xì)胞分散效果差。2023/10/27192023/10/27剪切法10mm3小塊休整、沖洗反復(fù)剪切至糊狀加入Hank’s液/無(wú)血清培養(yǎng)液反復(fù)吹打離心去上清組織小塊用于培養(yǎng)2023/10/27202023/10/272023/10/27212023/10/27消化分離法組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀）；進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)使團(tuán)塊膨松使細(xì)胞團(tuán)塊充分分散；接種培養(yǎng)，細(xì)胞容易貼壁生長(zhǎng)。

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酶的生化作用

非酶的化學(xué)作用少量細(xì)胞團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的懸液2023/10/27222023/10/27方法

1-2mm3小塊，3-5倍體積胰蛋白酶攪拌（慢）消化20-60min（30）若時(shí)間長(zhǎng)，取2/3上清/15min,離心收細(xì)胞加入新胰酶繼續(xù)消化過(guò)100目網(wǎng)篩離心、漂洗、計(jì)數(shù)、稀釋、接種培養(yǎng)（0.5Χ106～1Χ106）2023/10/27232023/10/27消化分離法的注意事項(xiàng)組織塊漂洗：2-3次除去組織中的鈣、鎂離子和血清。防止抑制胰蛋白酶和EDTA的作用。胰蛋白濃度不宜過(guò)高，作用時(shí)間不能太長(zhǎng)，以避免毒性作用。消化后組織漂洗，避免毒性產(chǎn)生。動(dòng)作要輕，避免膨松的細(xì)胞隨漂洗而丟失。2023/10/27242023/10/27計(jì)數(shù)板的認(rèn)識(shí)兩個(gè)計(jì)數(shù)室每個(gè)：長(zhǎng)3mm;寬3mm;高0.1mm=0.9mm3一個(gè)大方格=0.1mm31×10-4ml(4大格細(xì)胞數(shù)之和/4)x1041ml懸液中細(xì)胞數(shù)2023/10/27252023/10/27計(jì)數(shù)方法準(zhǔn)備：計(jì)數(shù)板、蓋玻片：酒精清潔，干燥；制備細(xì)胞懸液：?jiǎn)渭?xì)胞，密度〉104個(gè)/mL；加樣：蓋玻片放于計(jì)數(shù)板中央吸少量懸液，從蓋玻片一側(cè)加入，不要溢出，不要過(guò)少，不要有氣泡。計(jì)數(shù):四角大方格總數(shù)壓線細(xì)胞：計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右2023/10/27262023/10/27125計(jì)算

細(xì)胞數(shù)/毫升原液=（4大格細(xì)胞數(shù)和/4）x104x稀釋倍數(shù)注意細(xì)胞分散良好出現(xiàn)較多細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)少于20個(gè)/1mm2細(xì)胞數(shù)多于50個(gè)/1mm2重制細(xì)胞懸液，重新計(jì)數(shù)。

每次吸取前要混勻計(jì)數(shù)時(shí)，遇細(xì)胞團(tuán)，按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算；262023/10/2727細(xì)胞密度換算溶液稀釋公式C1xV1=C2xV2C1、V1表示稀釋前的濃度和體積C2、V2表示稀釋后的濃度和體積例：現(xiàn)有108/ml懸液，配制106/ml懸液10mL，如何配制？

108xV1=106x10V1=107/108=0.1毫升即取原液0.1毫升，加9.9毫升培養(yǎng)基，混勻。2023/10/272023/10/27282023/10/27四、接種培養(yǎng)2023/10/27292023/10/27（一）組織塊培養(yǎng)法特點(diǎn)常用、簡(jiǎn)便易行、成功率較高；培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)不是每一組織塊都能長(zhǎng)出細(xì)胞。瓶壁可預(yù)先涂以膠原薄層，利于組織塊粘著瓶壁，周邊細(xì)胞能沿瓶壁向外生長(zhǎng)。2023/10/27302023/10/27125具體步驟剪1mm3小塊，剪切時(shí)保持濕潤(rùn)；小塊均勻擺放，間隔0.5cm；輕輕反轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，底朝上，加入適量培養(yǎng)液，37度靜置2-4hr；待組織塊貼敷后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，靜置培養(yǎng)；注意事項(xiàng)翻轉(zhuǎn)時(shí)動(dòng)作輕，防沖起；觀察：污染及時(shí)清除；3~5天換液，去除組織塊、血細(xì)胞及細(xì)胞碎片。2023/10/27312023/10/27125312-4hr2023/10/27322023/10/27125注意：隨時(shí)鏡檢，分散成單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)停止消化32（二）消化培養(yǎng)法2023/10/27332023/10/27（三）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無(wú)需消化；低速離心分離，直接培養(yǎng)或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。2023/10/27342023/10/27（四）器官培養(yǎng)

指從供體取得器官或器官組織塊后，直接在體外特定環(huán)境條件下培養(yǎng)；要求:保持器官的相對(duì)完整性；目的：觀察細(xì)胞間的聯(lián)系、排列情況、相互影響，以及局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用。2023/10/27352023/10/27注意防止器官中心壞死；所以保證氧的供給；組織塊厚度或直徑不易超過(guò)1mm；組織塊不能完全浸入培養(yǎng)液；2023/10/27362023/10/27方法凝固的血漿基質(zhì)培養(yǎng)法平皿表面有一層凝固的雞血漿/雞胚浸出液缺點(diǎn)：組織周?chē)难獫{凝塊發(fā)生浸潤(rùn)，器官陷入培養(yǎng)基。瓊脂基質(zhì)培養(yǎng)法血漿、雞胚浸出液和滅菌瓊脂混合，形成穩(wěn)定的半固體培養(yǎng)基，進(jìn)行表面培養(yǎng)。彌補(bǔ)方法1的不足2023/10/27372023/10/27漂浮法擦鏡紙打孔/醋酸纖維素薄膜/微孔濾膜上放置器官培養(yǎng)。格柵培養(yǎng)法

漂浮的薄膜有時(shí)會(huì)下沉，引入金屬格柵，組織塊放在金屬格柵上，培養(yǎng)液與格柵奇平。交替暴露于培養(yǎng)基和氣相培養(yǎng)法2023/10/27382023/10/27原代培養(yǎng)要求（貼壁細(xì)胞）充分漂洗，盡量除去消化液的毒性；接種時(shí)濃度要稍大一些；血清濃度高一