杜仲葉功能組分的分離與鑒定

杜仲葉功能組分的分離與鑒定

杜仲是中國傳統(tǒng)的稀有中藥，其藥用價(jià)值一直受到人們的關(guān)注?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)杜仲葉與皮的化學(xué)成分基本一致,具有同等功效,特別是其綠原酸和黃酮的含量遠(yuǎn)高于皮中的含量[1~3],因此分離與鑒定杜仲葉的功能因子研究具有一定的應(yīng)用價(jià)值。黃酮類化合物是一類在植物界中分布廣泛且重要的多酚類天然產(chǎn)物,具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗菌、降血脂、治療心血管疾病等生物活性。有研究表明,杜仲黃酮的主要成分為槲皮素和槲皮苷等[4~6]。MucsiI等人研究發(fā)現(xiàn)槲皮素、槲皮苷、蘆丁和橙皮苷等黃酮類化合物通過刺激AMP的合成而達(dá)到抑制皰疹病毒活性的目的,尤其以槲皮素和槲皮苷的抑制活性較為明顯。目前已知的黃酮類化合物單體已超過8000種,可分為黃酮類、黃酮醇類、異黃酮、查耳酮、橙酮、花青素以及上述各類的二氫衍生物。將杜仲葉提取物進(jìn)行分離純化,所得黃酮類單體化合物經(jīng)光譜鑒定,含有綠原酸、槲皮素、山柰酚、紫云英苷、異槲皮苷、蘆丁、槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖甙、槲皮素-3-O-葡萄糖基-(1→2)-阿拉伯糖苷或槲皮素-3-O-木糖基-(1→2)-葡萄糖苷等物質(zhì)。本文以杜仲葉為原料,采用乙醇超聲波輔助水提法,經(jīng)大孔樹脂NKA-Ⅱ、聚酰胺SephadexLH-20樹脂柱層析對粗提物逐一分離、純化,從杜仲葉粗提物中分離得到4種精提物組分,然后通過薄層色譜(TLC)、紫外光譜(UV)、高效液相色譜(HPLC)和電噴霧電離源-質(zhì)譜(ESI-MS)對精提物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析與鑒別,為杜仲葉活性成分的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1藥品、化學(xué)品試劑杜仲葉,浙江省開化縣杜康茶業(yè)有限公司;NKA-Ⅱ樹脂,西安藍(lán)深特種樹脂有限公司;聚酰胺粉(80~100目),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;SephadexLH-20,美國GE公司。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品,中國藥品生物制品檢定所;甲酸、甲醇(色譜純),美國SIGMA-ALDRICH公司;無水乙醇、冰乙酸、正丁醇、三氯甲烷、石油醚、鹽酸、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉均為分析純;重蒸水。1.2設(shè)備與技術(shù)指標(biāo)均有了新的發(fā)展空間超高效液相色譜分析系統(tǒng)(ACQUITY),配置ACQUITY自動(dòng)進(jìn)樣器;高分辨四極桿與飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀(Q-TOFPremier),美國WATERS公司;數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(MassLynx4.1),美國WATERS公司;超純水系統(tǒng),法國MILLIPORE公司;電腦全自動(dòng)部份收集器(DBS-100)、紫外檢測儀(HD-3)、電腦恒流泵(DHL-A)、電腦采集器(HD-A),上海滬西分析儀器廠有限公司;點(diǎn)樣毛細(xì)管,上海申立玻璃儀器有限公司;硅膠板(GF254)5cm×15cm,上海信誼儀器廠;手提紫外檢測燈(ZF-7型),上海顧村電光儀器廠;層析柱,上海廈美生化科技發(fā)展有限公司;超聲清洗機(jī)(JP300型),武漢嘉鵬電子有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(HeidolphLaborota4000efficient);紫外-可見分光光度計(jì)(UNICOUV-2102PC型);萬分之一電子天平(AL204),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;真空冷凍干燥機(jī)(MODULYOD-230),THERMOELECTRON公司。1.3測試方法1.3.1杜仲葉中綠原酸、總黃酮的提取、分離和精制方法1.3.1.超聲輔助提取法杜仲葉殺青(180℃)→攤晾→烘干(80~90℃)→粉碎→石油醚脫脂→70%乙醇超聲波輔助水提→離心→取上清液濃縮→冷凍干燥→杜仲葉粗提物。1.3.1.洗脫部分的分離純化取600g杜仲葉粗提物,用大孔樹脂NKA-Ⅱ(玻璃層析柱7.6cm×70cm)分離,水(18L)、30%乙醇(9L)、50%乙醇(15L)、70%乙醇(12L)、90%乙醇(3L)依次洗脫。經(jīng)化學(xué)反應(yīng)、薄層層析和HPLC檢測,30%洗脫部分的主要成分是綠原酸類物質(zhì),70%洗脫部分的主要成分是黃酮類物質(zhì),故選擇30%和70%洗脫部分進(jìn)行分離純化。稱取25g30%洗脫部分,經(jīng)聚酰胺柱(80~100目)分離,乙醇-水(0%、10%、20%、30%、40%)梯度洗脫,Fr21~70經(jīng)SephadexLH-20純化,收集白色晶體組分Ⅰ。稱取25g70%洗脫部分,經(jīng)聚酰胺柱(80~100目)分離,乙醇-水(0%、30%、40%、50%、60%、70%、90%)梯度洗脫,Fr27~73、Fr105~150、Fr295~315分別經(jīng)SephadexLH-20純化,得黃色晶體組分Ⅱ、組分III、組分Ⅳ,分析這4種精提物組分(Ⅰ、Ⅱ、III和Ⅳ)。1.3.2展開劑為5種多素類似物的標(biāo)準(zhǔn)品與杜仲葉粗提物的篩選干燥器中的薄層板使用前需在100℃烘箱中活化1h。由于黃酮類分子中含有酚羥基,酸性展開劑有利于分離,因此在展開劑中加入少量的乙酸,以改善拖尾,實(shí)現(xiàn)更佳的分離效果。本試驗(yàn)中使用的展開劑為V(正丁醇)∶V(水)∶V(乙酸)=50∶50∶0.1,充分搖勻,靜置后取上層液備用。采用綠原酸、牡荊素、蘆丁、楊梅素、槲皮素、木犀草素和山柰酚7種標(biāo)準(zhǔn)品與杜仲葉粗提物進(jìn)行對照分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)的杜仲葉粗提物中綠原酸、蘆丁、槲皮素3種類似物含量較多。于是選用綠原酸、蘆丁、槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)品及杜仲葉的4種精提物組分進(jìn)行分析。將它們的乙醇溶液點(diǎn)樣于薄層板上,展開劑分離后噴入AlCl3顯色劑,得薄層圖譜,再置紫外燈(365nm)下檢測,計(jì)算R值。Rf值計(jì)算公式:Rf=溶質(zhì)斑點(diǎn)中心的移動(dòng)距離/溶劑前沿移動(dòng)的距離1.3.3杜仲葉精提物的紫外吸收光譜圖將杜仲葉的精提物粉末及綠原酸和槲皮素標(biāo)品分別用無水甲醇溶解,以無水甲醇為參比,用紫外-可見分光光度計(jì)在波長200~400nm范圍掃描,得到杜仲葉精提物和兩種標(biāo)樣的紫外吸收光譜圖,進(jìn)行對照分析。1.3.4hplc-ms法1)對照溶液的制備:分別精密稱取綠原酸、牡荊素、蘆丁、楊梅素、槲皮素、木犀草素和山柰酚7種對照品,用甲醇溶解,等體積混合,制成一定濃度的7種混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(作為對照液),然后用0.25um的微孔濾膜過濾,置于-20℃冰箱備用。2)供試品溶液的制備:準(zhǔn)確稱取杜仲葉精提物,其中組分Ⅰ0.0027g、組分Ⅱ0.0019g、組分II-I0.0018g、組分Ⅳ0.0016g,置于10mL容量瓶中,用無水甲醇(色譜純)溶解,定容至刻度,搖勻,然后用0.25μm微孔濾膜過濾,置于-20℃冰箱中,待HPLC和ESI-MS檢測。3)色譜條件:色譜柱:ACQUITYUPLCBEHC18(100mm×2.1mm,1.7m),美國WATERS公司;柱溫25℃;流速0.35mL/min;檢測波長365nm;進(jìn)樣量5uL;流動(dòng)相采用梯度洗脫方式:流動(dòng)相A為水+0.1%甲酸,B為甲醇+0.1%甲酸,0~0.3min,A與B體積比90∶10;0.3~10min,A與B體積比5∶95;10~10.5min,A與B體積比0∶100。4)質(zhì)譜條件:電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)法,負(fù)離子模式;離子源溫度125℃;去溶劑溫度250℃;脫溶劑氣流量400L/h;錐孔氣流量50L/h;毛細(xì)管電壓2.5kV,錐孔電壓50V;質(zhì)譜掃描范圍100~1200m/z。2結(jié)果與分析2.1組成中的成分及展開體系的穩(wěn)定性分析藥典方法中檢測黃酮類成分的顯色劑多為三氯化鋁乙醇溶液。在中藥分析中,與三氯化鋁乙醇溶液反應(yīng)呈色并產(chǎn)生熒光是黃酮類成分的特征鑒別方法。本試驗(yàn)中采用三氯化鋁乙醇溶液為顯色劑,檢測到E、F、G3個(gè)斑點(diǎn)呈亮黃色并帶有熒光,即黃酮類成分。圖1中A、B、C分別為綠原酸、蘆丁、槲皮素3種標(biāo)準(zhǔn)品,組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ分別以字母D、E、F和G表示。如圖所示,A、B、C3個(gè)斑點(diǎn)清晰,圓而集中,不拖尾,表明此展開體系對該類物質(zhì)的薄層層析效果顯著。結(jié)合紫外燈觀察,杜仲葉精提物的4種組分均為單一斑點(diǎn),表明4種組分的成分較單一。各組分的Rf值見表1,其中綠原酸、蘆丁、槲皮素的Rf值分別為0.263、0.500、0.763;組分Ⅰ的Rf值為0.263,與綠原酸標(biāo)品一致;組分Ⅳ的Rf值為0.737,與槲皮素標(biāo)品接近;組分Ⅱ的Rf值為0.632,介于蘆丁與槲皮素之間;組分Ⅲ的Rf值為0.211,說明組分Ⅲ在此弱極性展開體系中的極性較強(qiáng),可能與其結(jié)構(gòu)有關(guān)(可能含乙酰葡萄糖基)。通過比較分析,判定組分Ⅰ為綠原酸類物質(zhì),組分Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ為黃酮類化合物。2.2黃酮與黃酮醇的紫外光譜特征稱取分離純化后的杜仲葉精提物粉末組分Ⅰ0.0027g、組分Ⅱ0.0019g、組分III0.0018g、組分Ⅳ0.0016g,用無水甲醇溶解、定容至10mL,搖勻。以無水甲醇為參比,進(jìn)行紫外掃描,紫外光譜圖見圖2。從圖2a可以看出,對組分Ⅰ的波長掃描結(jié)果與綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品相似,組分Ⅰ在波長200~400nm范圍的最大吸收波長是324nm,綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收波長是330nm,兩者最大吸收波長存在差異,其原因有待查。黃酮和黃酮醇的紫外光譜在波長220~400范圍有2個(gè)吸收帶。將處于300~400nm區(qū)域的吸收帶稱為帶Ⅰ,將處于220~280nm區(qū)域的吸收帶稱為帶Ⅱ。黃酮的分子由2個(gè)生色團(tuán)組成,即A環(huán)的苯甲?；虰環(huán)的肉桂酰基,二者互相影響。帶Ⅰ主要與肉桂?；珗F(tuán)有關(guān),帶Ⅱ與甲苯酰基生色團(tuán)有關(guān)。如圖2b、2c、2d所示,杜仲葉精提物組分Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ在甲醇中的紫外吸收光譜符合黃酮和黃酮醇的紫外光譜特征。另外,根據(jù)MeOH譜的峰形,可初步判斷化合物的母核結(jié)構(gòu)。當(dāng)帶Ⅰ和帶Ⅱ峰強(qiáng)相似,且均為主峰時(shí),多為黃酮、黃酮醇或其苷類物質(zhì)。當(dāng)帶Ⅰ>350nm,則多為黃酮醇或其苷類。從表2可以看出,杜仲葉精提物中組分Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的甲醇溶液在波長220~280nm范圍有帶Ⅱ吸收峰,說明這3個(gè)組分均含有A環(huán)-苯甲酰基團(tuán),且3個(gè)組分的帶ⅡUVmax與槲皮素的帶ⅡU-Vmax255nm相近,表明A環(huán)的C-5,7可能被羥基(-OH)取代。另外根據(jù)黃酮類化合物的羥基取代位置對其紫外光譜影響的結(jié)果對照,進(jìn)一步驗(yàn)證了該推斷的成立。同樣,3組分的甲醇溶液在300~400nm處有帶Ⅰ吸收峰,說明3組分均含有B環(huán)-肉桂?；鶊F(tuán)。組分Ⅳ與槲皮素在波長367nm處有大吸收峰,符合黃酮醇類化合物在C環(huán)C-3有羥基(-OH)取代的紫外光譜特征。另外,組分Ⅱ和組分Ⅲ的帶ⅠUVmax相比槲皮素的帶ⅠUVmax367nm分別紫移動(dòng)了18nm和22nm,說明可能存在3-OH的糖苷化?？傊?組分Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ具有黃酮類化合物C6-C3-C6的基本母體骨架,其中組分Ⅱ、Ⅲ可能屬黃酮苷類,組分Ⅳ可能是槲皮素。為了驗(yàn)證這一推斷,需分析色譜和質(zhì)譜結(jié)果。2.3組分的質(zhì)譜特征對7種標(biāo)準(zhǔn)品混合液及杜仲葉精提物的4個(gè)組分,分別進(jìn)行HPLC和ESI-MS分析,試驗(yàn)結(jié)果如圖3~圖7所示。圖3顯示,綠原酸標(biāo)品的出峰時(shí)間為2.65min,圖3b中出現(xiàn)m/z=353.08,為綠原酸的準(zhǔn)分子離子[M-H]-。其中,m/z=191的碎片為1,3,4,5-四羥基環(huán)己烷羧酸特征基團(tuán),是從單個(gè)綠原酸分子上斷裂形成的;而m/z為707.18和1061.29的質(zhì)譜峰分別是綠原酸的二聚體(相對分子質(zhì)量708)和綠原酸三聚體(相對分子質(zhì)量1062)的準(zhǔn)分子離子。槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為5.73min,由圖3c推測m/z=301.03的質(zhì)譜峰是槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)分子離子[M-H]-。組分Ⅰ為淺綠色粉末,圖4中的紫外檢測圖譜顯示其出峰時(shí)間為2.66min,與綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間相近。組分Ⅰ的質(zhì)譜圖中也出現(xiàn)m/z=353.08的準(zhǔn)分子離子[M-H]-和m/z=191.07的碎片以及m/z=707.18的二聚體,與綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜峰一致,故組分Ⅰ為綠原酸。所有樣品的檢測條件相同,根據(jù)綠原酸的質(zhì)譜圖解析模式對組分Ⅱ進(jìn)行分析。圖5顯示,m/z分別為463.09和927.18的質(zhì)譜峰可能是組分Ⅱ的準(zhǔn)分子離子[M-H]-和二聚體分子離子[2M-H]-,而m/z=301.03的質(zhì)譜峰是組分Ⅱ的準(zhǔn)分子離子去掉1個(gè)六碳糖基的離子峰[M-H-162]-。圖5也證實(shí)了m/z=162.89的碎片存在。根據(jù)文獻(xiàn)[10-11,16]推測組分Ⅱ的相對分子質(zhì)量為464,推測可能是金絲桃苷或陸地錦苷。由圖6可以推測組分Ⅲ的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-是m/z=505.09的質(zhì)譜峰。另外,根據(jù)后期的紅外光譜檢測和一級核磁共振(1H-NMR、13C-NMR)圖譜推斷m/z=300.02的質(zhì)譜峰很可能是組分Ⅲ去掉1個(gè)m/z=204的乙酰葡萄糖苷基團(tuán)而得到的離子峰[M-H-204]-。根據(jù)紫外光譜特征及黃酮體化合物鑒定手冊,推測組分Ⅲ可能是槲皮素-3-乙酰葡萄糖苷,需進(jìn)行驗(yàn)證。圖7顯示組分Ⅳ的出峰時(shí)間為5.73min,與槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間相同,質(zhì)譜圖中也出現(xiàn)m/z=301.03的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-和m/z=603.07組分Ⅳ的二聚體[2M-H]-,與槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖一致,故組分Ⅳ為槲皮素,其純度高于96%。對于4種杜仲葉精提物組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式有待下一階段的核磁共