益智寧神顆粒治療兒童注意缺陷多動障礙的神經(jīng)機制研究

益智寧神顆粒治療兒童注意缺陷多動障礙的神經(jīng)機制研究

兒童容易運動的缺陷（advd）被稱為兒童障礙。這是學齡兒童中發(fā)病率高的心理障礙疾病，可能會嚴重影響兒童的身心健康和學習能力。臨床中筆者采用益腎填精、寧神益智之益智寧神顆粒治療本病取得了滿意療效。近來研究發(fā)現(xiàn),本病的發(fā)生與患兒血清去甲腎上腺素(NE)功能不足,多巴胺(DA)與NE失衡,引起單胺類神經(jīng)遞質的代謝紊亂密切相關。本實驗以目前國際上使用最為廣泛的ADHD動物模型———自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)為研究對象,通過觀察大鼠腦組織DA、NE含量的變化,初步探討益智寧神顆粒治療ADHD的神經(jīng)生化機制。1實驗材料1.1實驗動物1.2siga公司NE、DA、3-甲氧-4-羥苯乙二醇(MHPC)、高香草(HVA)均為Sigma公司產(chǎn)品。高氯酸(分析純)、辛烷磺酸鈉(色譜級)、乙二胺四乙酸(EDTA)(分析純)、磷酸二氫鉀(分析純)、磷酸(分析純)、乙腈(色譜純)、甲醇(色譜級)、水(超純水)均由天津中醫(yī)藥大學實驗中心提供。1.3檢測儀器和設備KQ-250E型超聲儀,為昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。Agilent1100高效液相色譜儀,為美國安捷倫科技公司產(chǎn)品。ANTECLEYDENDECADEⅡ電化學檢測器,為美國AntecLeyden公司產(chǎn)品。梅特勒-托利多AX205分析天平,為瑞士梅特勒-托利多公司產(chǎn)品。XW-80A型微型渦旋混勻器,為上海滬西分析儀器廠產(chǎn)品。Beckman高速離心機,為美國貝克曼庫爾特公司產(chǎn)品。Gilson移液器,為法國吉爾森公司產(chǎn)品。超純水系統(tǒng)Millipore,為美國密理博公司產(chǎn)品。1.4試驗樣本的配制1)益智寧神顆粒:由紫河車、熟地黃、遠志、澤瀉、石菖蒲、黃連等組成,由天陰制藥有限公司提供。按高、中、低給藥劑量以蒸餾水配制(每次灌胃時當場配置),配成生藥含量分別為3.75、2.8125、1.875kg/L。2)利他林片:為蘇州醫(yī)藥集團有限公司產(chǎn)品,每次灌胃時當場配制,所配懸濁液濃度為0.625g/L。3)靜靈口服液:為吉林東方人制藥有限公司產(chǎn)品,可直接灌胃。2學習方法2.1智寧神顆粒量的模型將48只SHR大鼠隨機分為6組:益智寧神顆粒高、中、低劑量組,靜靈口服液組,利他林組,模型組。將8只同齡Wistar大鼠設為正常對照組。2.2林分和劑量選擇1)益智寧神顆粒高、中、低劑量組:灌服益智寧神顆粒沖劑,劑量分別為37.5、28.125、18.75g/kg,1次/d,持續(xù)7d。2)利他林組:灌服利他林6.25mg/kg,1次/d,持續(xù)7d。3)靜靈口服液組:灌服靜靈口服液12.5mL/kg,1次/d,持續(xù)7d。4)正常對照組、模型組:蒸餾水10mL/kg,1次/d,持續(xù)7d。2.3檢測方法應用高效液相—電化學法進行檢測2.3.2養(yǎng)老器檢測參數(shù)流動相比例:水相∶甲醇∶乙腈=78∶19∶3,色譜柱型號:WatersRP-C18柱(3.9mm×150mm,5μm),流速:0.8mL/min,柱溫:35℃,檢測器參數(shù):Range:200nA;Ec:+0.7V;Filt:0.1Hz;電極:銀-氯化銀(Ag-AgCl)電極。因流動相中使用了離子對試劑,所以進樣分析前以0.8mL/min的流速用流動相平衡色譜柱約2h后再進樣,保留時間穩(wěn)定且峰形良好。2.3.3標準品溶液的配制分別精密稱取NE、DA、HVA各1.0mg,分別置于10mL容量瓶中,加超純水至刻度,作為標準品儲備液,0.1g/L。分別取上述3種標準品儲備液適量轉移至10mL容量瓶中,再用超純水稀釋至刻度,稀釋成濃度分別為8、20、40、60、200、500μg/L的NE對照品溶液,濃度分別為20、40、60、200、500、1000mg/L的DA對照品溶液,濃度分別為20、40、60、200、500、1000μg/L的HVA對照品溶液,用0.45μm的微孔濾膜過濾,取濾液備用。2.3.4兩個生產(chǎn)線性的回歸分析取上述一系列稀釋好的標準液,各個濃度均精密吸取10μL進樣分析。以NE、DA、HVA的濃度C(mg/L)為橫坐標,峰面積A為縱坐標,繪制標準曲線。NE的線性回歸方程為A=3.0810C-12.7600,R^2=0.9984,NE在8~500μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關系;DA的線性回歸方程為A=2.1895C-2.3607,R^2=0.9997,DA在20~1000μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關系;HVA的線性回歸方程為A=2.5984C-1.9985,r=0.9957,HVA在20~1000μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關系。2.3.5進樣穩(wěn)定性測定取適當濃度的NE、HVA、DA標準品溶液,進樣10μL/次,分別連續(xù)進樣6次,測定NE、HVA、DA的峰面積,求算精密度,結果峰面積(RSD)分別為1.17%、0.90%、1.37%。2.3.6大腦皮質的制備大鼠斷頭處死后迅速取腦,在置于冰浴中且墊有潮濕濾紙的玻璃器皿上迅速剝離大腦皮質和小腦,將剩余部分稱質量后,放入置于冰浴中的硯缽中,加入4mL高氯酸,勻漿2min。所得勻漿液用高速冰凍離心機12000r/min離心15min,吸取上清液10μL,進樣分析。2.4統(tǒng)計處理實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示,統(tǒng)計方法采用SPSS11.0軟件包處理,進行單因素方差分析。3智寧神顆粒對大鼠體內(nèi)da、ne含量的影響結果見表1。統(tǒng)計結果表明:與正常對照組比較,模型組大鼠腦組織中DA、NE含量顯著增高,HVA無明顯差異,提示DA、NE兩者含量的顯著增高可能是ADHD發(fā)病的神經(jīng)生化機制。益智寧神顆粒高劑量組大鼠腦組織中DA、NE含量顯著降低;益智寧神顆粒中、低劑量,利他林及靜靈口服液組,對大鼠腦組織中DA、NE含量無顯著影響。4adhd發(fā)病機制的研究ADHD是學齡時期高發(fā)的一種精神行為障礙性疾患,屬中醫(yī)“躁動”、“失聰”、“健忘”等范疇。經(jīng)過多年的臨床實踐,筆者認為本病病機為“腎精虧虛,陰陽失調,陽動有余,陰靜不足,臟腑功能失常,致腦髓失養(yǎng)”,據(jù)此確立了“益腎填精,寧神益智”治療大法,研制出“益智寧神顆?！?重在應用既可補腎氣又可滋腎陰的血肉有情之品,起到腎陰腎陽并重,協(xié)調陰陽的目的。方中紫河車,入腎經(jīng),養(yǎng)血益精。熟地黃,入肝、腎二經(jīng),滋陰補血。兩者共為君藥,益腎填精,補腦益智,以達治動之本。石菖蒲開竅、豁痰、理氣、活血,遠志安神益智、解郁,兩藥共為臣藥,寧心柔肝,開竅定志,以達治動之標。澤瀉,甘寒,有瀉熱之效,為“反佐”之意,以免溫燥太過,并可引諸藥歸于腎。黃連,苦寒,瀉心肝之火熱,交通心腎,為使藥。諸藥合用,共奏益腎、填精益智,寧心安神,柔肝清火之功,最終平衡陰陽,協(xié)調臟腑功能,使精氣充足,腦神得養(yǎng),智力提高,情緒穩(wěn)定,學習效率提高。由于ADHD在學齡期兒童中患病率較高,因此20世紀90年代在國際上掀起了對ADHD的研究高潮,對于神經(jīng)生化機制的研究也逐漸增多。HalperinJM曾指出ADHD是與兒茶酚胺類神經(jīng)遞質NE功能異常相關的病癥,其異常變化與患兒臨床表現(xiàn)特征有密切聯(lián)系。GirosB等利用基因敲除技術,敲除DAT基因,來研究DAT與ADHD的關系,發(fā)現(xiàn)DAT敲除小鼠具有ADHD活動過度、認知缺陷,并且活動過度的現(xiàn)象可被利他林等精神興奮劑所改變等,利他林可以通過抑制DAT而間接增強DA功能,從而發(fā)揮治療作用,故提出DA功能異?？赡苁茿DHD的發(fā)病基礎。由于DA可促進運動、攻擊行為和性行為,其含量異常增加可導致過度的運動和攻擊性行為,類似ADHD的活動過多、沖動等行為;但同時NE增加則能促進良好注意和有選擇注意、條件反射早、出現(xiàn)焦慮早、過度抑制、內(nèi)向等,其含量增加的表現(xiàn)似乎與ADHD注意力不集中的臨床表現(xiàn)不相符,所以以上文獻應用單一神經(jīng)遞質假說去解釋ADHD的病理機制,難免不全面。本實驗中,大鼠腦組織中兒茶酚胺類神經(jīng)遞質及其代謝產(chǎn)物DA、NHVA含量異常,主要表現(xiàn)為模型組大鼠腦組織中DA、NE含量顯著多于正常對照組,雖與上述文獻報道含量降低不相一致,但支持2001年JonesMD對活動過度的SNAP-25的突變?nèi)笔∈筮M行研究,發(fā)現(xiàn)兒茶酚胺類神經(jīng)遞質的改變與活動過度密切關系,認為腦組織中紋狀體的DA、NE均增高,是造成多動的主要原因。此種活動過度的SNAP-25突變?nèi)笔∈笫?996年WilsonMC等通過對小鼠神經(jīng)系統(tǒng)進行X線照射來進行造模,其中Cm+/-雜合子小鼠表現(xiàn)出多動癥的核心癥狀:自發(fā)性活動過度、神經(jīng)發(fā)育落后等,小劑量右旋安非他明可有效降低多動,但利他林卻呈劑量依賴性地增加模型組小鼠的運動水平。KiehlR測得ADHD患兒血漿DA、NE也均高于正常對照組。故對于ADHD發(fā)病機制的探討,需將本實驗結果,同時與上述DA、NE兩種神經(jīng)遞質功能以及ADHD臨床表現(xiàn)相結合,進而可以得出這樣的結論:腦組織中DA、NE含量均顯著增加,而且兩者平衡失調,即相對于DA含量較高,NE處于相對低下的水平,是ADHD發(fā)病的神經(jīng)生化機制。正常情況下,兒茶酚胺類神經(jīng)遞質相互作用處于一種平衡狀態(tài),任一遞質的含量增高或降低都會導致功能失調,所以上述諸多文獻報道并非相矛盾,而是不夠全面。治療組中,中藥高劑量組大鼠腦組織中DA、NE含量的降低,與模型組存在顯著差異,說明高劑量中藥能明顯降低腦組織中DA、NE含量,糾正兒茶酚胺類神經(jīng)遞質的不平衡狀態(tài);利他林組只是NE含量有所降低,統(tǒng)計學無意義,可能與其治療機制是促進突觸間隙NE的釋放并阻止其再攝取,表現(xiàn)出的NE功能增強,注意力集中,對于DA含量以及兩者平衡的恢復作用不明顯。選用健康雄性SHR大鼠48只,同齡Wistar大鼠8只,體質量(50±10)g,購自北京維通利華實驗技術有限公司。自然光照,自由進食,分籠飼養(yǎng),飼料為固定配方的大鼠飼料,適應性喂養(yǎng)3d后開始實驗。2.3.1標品溶液的配制1)全部實驗需用超純水,除Sigma公司提供標準品外,所有化學試劑均須優(yōu)質純或分析純。2)神經(jīng)遞質標準品儲備液配制:精確稱量NE