蛋白質(zhì)A的表達(dá)、制備及鑒定

XXX大學(xué)

生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)論文論文題目:所在班級(jí):學(xué)號(hào):學(xué)生姓名:指導(dǎo)老師:時(shí)間:《蛋白質(zhì)A的表達(dá)、制備及鑒定》生物技術(shù)XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX2010.9—2010.11TOC\o"1-5"\h\z一、 前言 31.1 有關(guān)SPA 3\o"CurrentDocument"1.1.1金黃色葡萄球菌A蛋白的簡(jiǎn)介 3\o"CurrentDocument"SPA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 3\o"CurrentDocument"SPA的生物活性 3\o"CurrentDocument"SPA的應(yīng)用 4\o"CurrentDocument"1.2實(shí)驗(yàn)相關(guān)原理 5\o"CurrentDocument"外源基因的表達(dá) 5\o"CurrentDocument"SDS檢測(cè)表達(dá)的蛋白質(zhì) 5\o"CurrentDocument"Westernblotting .6二、 材料與方法 72.1材料 7\o"CurrentDocument"2.1.1表達(dá)載體與抗體 7\o"CurrentDocument"2.1.2主要儀器 7\o"CurrentDocument"2.1.3主要藥品和溶液 7SPA基因的誘導(dǎo)表達(dá) 7\o"CurrentDocument"Westernblotting .10\o"CurrentDocument"2.2方法 11\o"CurrentDocument"SPA的表達(dá) 11\o"CurrentDocument"SPA的提取 12\o"CurrentDocument"破細(xì)胞收菌 12\o"CurrentDocument"SDS-PSGE檢測(cè)表達(dá)的蛋白質(zhì) 12\o"CurrentDocument"Westernblottong 13三、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 133.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果 13SDS檢測(cè)表達(dá)的蛋白質(zhì) 13westernblotting14\o"CurrentDocument"3.2結(jié)果分析 14SDS的分析 14westernblotting的分析14\o"CurrentDocument"綜述 15實(shí)驗(yàn)討論 15\o"CurrentDocument"SDS的討論 15westernblotting 的討論16\o"CurrentDocument"3.3.3實(shí)驗(yàn)建議 16四、 結(jié)語(yǔ) 17【摘要】：本試驗(yàn)通過(guò)用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA),IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)，用超聲波破細(xì)胞收菌提取SPA，SDS及westernblotting分析，完成了對(duì)SPA的表達(dá)、制備、鑒定?！娟P(guān)鍵詞】：SPASDSwesternblotting一、前言1.1有關(guān)SPA1.1.1金黃色葡萄球菌A蛋白的簡(jiǎn)介金黃色葡萄球菌A蛋白(StaphylococcalProteinA、簡(jiǎn)稱SPA)是細(xì)胞壁抗原的主要成分，幾乎90%以上的菌株均含有這種成分，但不同的菌株含量差別十分懸殊。SPA存在于大多數(shù)(90%)金黃色葡萄球菌中，而不存在于表皮葡萄球菌中，并且主要存在于血漿凝固酶陽(yáng)性菌株，而不存在于陰性菌株中，前者是致病的，后者是非致病的SPA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)SPA為蛋白質(zhì)成分，由三部分組成，第一部分為信號(hào)肽序列；第二部分為與lgG結(jié)合的E、D、A、B、C五個(gè)高度重復(fù)的功能域，每區(qū)由58個(gè)以上的氨基酸組成，不含色氨酸和半胱氨酸；第三部分為蛋白質(zhì)與細(xì)胞壁肽聚糖結(jié)合的具有高度重復(fù)序列的功能域，共有395個(gè)氨基酸殘基，蛋白紫外光譜為275nM，等電點(diǎn)為pH5.1，僅含少量或不含碳水化合物。一般在每個(gè)菌體細(xì)胞壁上約有 8萬(wàn)個(gè)SPA分子，約占細(xì)胞壁總重的6.7%。因提取及測(cè)定方法不同其分子量有差異，用脫氧核糖核酸酶消化細(xì)胞壁后超速離心或用加熱油提法，所測(cè)分子量為 12000-15000D，用沉淀平衡分析和在6mol/L鳥(niǎo)嘌吟鹽酸鹽中凝膠過(guò)濾，測(cè)出分子量為42000D。其天然結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，在應(yīng)用6mol/L鳥(niǎo)嘌吟鹽酸鹽變性劑的條件下，尚能保存某些三級(jí)結(jié)構(gòu)，如將此變性劑除去，則能自然矯正而恢復(fù)原有結(jié)構(gòu)［1。SPA的生物活性SPA能與血清IgG起反應(yīng)，作用部位是IgGFc段而不是Fab段，認(rèn)為IgG與SPA的結(jié)合是非特異性的“假免疫反應(yīng)”，這種結(jié)合不會(huì)影響抗體的活性?，F(xiàn)己表明 SPA除與人血清中的IgG結(jié)合外還能與豚鼠、小白鼠、狍、豬、貂、猴，北極熊等動(dòng)物血清中的IgG結(jié)合，其中與豬的IgG結(jié)合力最強(qiáng)，與大白鼠、羊、雞、刺猬、魚(yú)類、兩棲類及大部分鳥(niǎo)類等動(dòng)物血清中的IgG不結(jié)合。SPA除與IgG結(jié)合還能與IgA2，和IgM反應(yīng)，SPA與IgM的結(jié)合區(qū)位于互補(bǔ)決定區(qū)及開(kāi)放讀碼框架， D結(jié)構(gòu)域與其他結(jié)構(gòu)域比較對(duì)IgM及IgA親和力較高。另外SPA是一種B細(xì)胞激活劑，具有對(duì)B淋巴細(xì)胞促有絲分裂作用，固相SPA作用明顯，并不需要T細(xì)胞輔助，可容性SPA作用微弱，必須有T細(xì)胞參與。由于IgG的Fc段結(jié)合點(diǎn)既是lgG調(diào)理活性結(jié)合點(diǎn)，又是SPA反應(yīng)點(diǎn)。因此，SPA可與吞噬細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)，結(jié)果抑制了多形核白細(xì)胞的吞噬作用，也可能是SPA阻斷調(diào)理素與吞噬細(xì)胞作用的結(jié)果。引起豚鼠離體回腸產(chǎn)生類似過(guò)敏反應(yīng)樣的收縮和家鼠局部過(guò)敏樣壞死，有研究顯示SPA與鼠類的膿毒性關(guān)節(jié)炎有關(guān)刺激機(jī)體免疫反應(yīng)刺激人體角膜細(xì)胞使其NF.1cB活化和細(xì)胞因子TNF-aand1I_,-8時(shí)間依賴性分泌，能劑量依賴性的刺激淋巴細(xì)胞分泌IgM抗體向lgG抗體的轉(zhuǎn)化口、3］。SPA的應(yīng)用SPA研基于SPA與IgG的Fc段的結(jié)合能力，自70年代開(kāi)始，國(guó)外應(yīng)用SPA建立了許多敏感、特異性強(qiáng)、快速和簡(jiǎn)易的實(shí)驗(yàn)方法， SPA在免疫學(xué)、微生物學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，并在許多方面的應(yīng)用中積累了實(shí)際應(yīng)用的材料，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用到免疫學(xué)及其相關(guān)科學(xué)如細(xì)胞學(xué)、細(xì)菌學(xué)和病毒學(xué)等。1.作為廣譜第二抗體由于SPA能與多種動(dòng)物的IgG的Fc段結(jié)合，因此，作為第二抗體或標(biāo)記抗體，SPA的最大優(yōu)點(diǎn)是不受種屬特異性的限制；用來(lái)純化免疫球蛋白由于SPA與IgG及其某些亞型的Fc段有較強(qiáng)的結(jié)合力，可利用來(lái)提純、分析免疫球蛋白制劑，結(jié)合后的 PSA.IgG可再用解離劑如4mol/L尿素、4mol/L，硫氰酸鹽或6mol/L的鳥(niǎo)嘌吟鹽酸鹽使之解離.大量研究表明SPA是一種比較理想的提純和分析免疫球蛋白的試劑 ⑶。應(yīng)用于免疫細(xì)胞化學(xué)由于SPA具有雙價(jià)結(jié)合力，在免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)中可作為橋抗體或標(biāo)記抗體，同樣，于SPA能與多種動(dòng)物的IgG的FC段結(jié)合，不受種屬特異性的限制，故在目前各種免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)中也已得到廣泛的應(yīng)用。 SPA分子量小(13000-42000)，易于穿透組織，而免疫球蛋白酶標(biāo)記抗體為200000，PAP復(fù)合物為430000，均較SPA分子量大?？勺鳛橐环N研究免疫復(fù)合物、膜抗原、膜受體和膜 Ig的固相吸附劑。SPA用于細(xì)胞膜抗原、表面IgG和Fc受體的研究最大特點(diǎn)是能研究活細(xì)菌。已得到愈來(lái)愈廣泛的應(yīng)用，是一種較為理想的免疫電鏡技術(shù)。其它方面隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，蛋白表達(dá)提出了越來(lái)越高的要求，將蛋白分泌到宿主菌體外能顯著降低菌體蛋白酶對(duì)異源蛋白的影響， 也降低了異源蛋白高效表達(dá)時(shí)容易出現(xiàn)包涵體的現(xiàn)象，人們將SPA的錨定序列構(gòu)建入表達(dá)載體與異源蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，使其能展示在菌體表面或分泌到培養(yǎng)基中，這樣還方便了蛋白純化。正是由于SPA的眾多特點(diǎn)及廣泛應(yīng)用，目前基因工程蛋白也有了大量研究，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，SPA必將在免疫學(xué)、微生物學(xué)、基因工程等領(lǐng)域得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用［4、5］。1.2實(shí)驗(yàn)相關(guān)原理1.2.1外源基因的表達(dá)將培養(yǎng)過(guò)夜的金黃色葡萄球菌體重懸后，采用蛋白酶K和SDSTris緩沖液充分裂解菌體；經(jīng)飽和酚抽提水相蛋白，于預(yù)冷的無(wú)水乙醇沉淀基因組DNA,最后保存于滅菌的去離子水中；經(jīng)PCR擴(kuò)增。回收PCR產(chǎn)物與載體用BamHI和HindIII消化表達(dá)載體，加T4DNA連接酶于4°C連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為感受態(tài)大腸桿菌DH5a［7］。1.2.2SDS檢測(cè)表達(dá)的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)分子是兩性電解質(zhì)分子，在直流電場(chǎng)內(nèi)可以移動(dòng)， PAGE過(guò)程中具有三種物理效應(yīng)：（1） 凝膠對(duì)樣品分子的篩選效應(yīng)（分子篩效應(yīng)）顆粒小、呈球形的樣品分子移動(dòng)快，顆粒大、形狀不規(guī)則的分子通過(guò)凝膠孔洞時(shí)的阻力大，移動(dòng)慢。（2） 不連續(xù)系統(tǒng)對(duì)樣品的濃縮效應(yīng)凝膠層的不連續(xù)：濃縮膠的孔徑大，分離膠的孔徑小，在電場(chǎng)的作用下，蛋白質(zhì)顆粒在大孔膠中泳動(dòng)時(shí)的阻力小，移動(dòng)快，而在小孔徑中，移動(dòng)慢。因而在兩層凝膠交界處，由于凝膠孔徑的不連續(xù)性使樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區(qū)帶。緩沖液離子成分及pH的不連續(xù)：在兩層凝膠中均有三羥甲基氨基甲烷（Tris）及HCI。Tris的作用是維持溶液的電中性及pH值，是緩沖配對(duì)離子，HCI在任何pH值溶液中均易解離出氯離子，它在電場(chǎng)中遷移率大，走在最前面，故稱為快離子或前導(dǎo)離子。電極緩沖液中的甘氨酸（Gly）在pH8.3的緩沖液中其解離度很小，僅為0.1%-1%，因而在電場(chǎng)中遷移率很小，稱為慢離子或尾隨離子。血清中，大多數(shù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)在5.0左右，在pH8.3或6.7時(shí)均帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中移向正極，其有效遷移率介于快慢離子之間，于是蛋白質(zhì)就在快慢離子間形成的界面出，被濃縮成極窄的區(qū)帶。三者的有效遷移率為m氯冬氯＞m蛋白a蛋白＞m甘冬甘（m為遷移率，冬為解離度），當(dāng)進(jìn)入pH8.9的分離膠時(shí)，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過(guò)蛋白質(zhì)，因此氯離子及甘氨酸離子沿著離子界面繼續(xù)前進(jìn)。蛋白質(zhì)分子由于分子量大，被留在后面，然后分成多個(gè)區(qū)帶，因此分離膠之間 pH的不連續(xù)性可控制其遷移率。在濃縮膠中要求慢離子較所有被分離樣品的有效遷移率低，以使樣品在快慢界面之間被濃縮。進(jìn)入分離膠后，慢離子的有效遷移率比所有樣品的有效遷移率高，使樣品不再受離子界面的影響。電位梯度的不連續(xù)性：電位梯度的高低與電泳速度的快慢有關(guān)。電泳開(kāi)始后由于快離子遷移率大，就會(huì)很快超過(guò)蛋白質(zhì)，在快離子后面形成一個(gè)離子濃度低的區(qū)域即低電導(dǎo)區(qū)。低的電導(dǎo)區(qū)就具有較高的電位梯度，而高的電位梯度又使蛋白質(zhì)和慢離子在快離子后面加速泳動(dòng)。當(dāng)三者的遷移率與電位梯度的乘積彼此相等時(shí)，三者的泳動(dòng)速度就相等。在快慢離子的移動(dòng)速度相等的文臺(tái)建立后，二者之間形成一個(gè)穩(wěn)定而又不斷向陽(yáng)極移動(dòng)的界面。而蛋白質(zhì)的有效遷移率在快慢離子之間，因此也就聚集在這個(gè)移動(dòng)附近，被壓縮成一個(gè)狹小的中間層。（3）電荷效應(yīng)當(dāng)進(jìn)入pH8.9的分離膠后，各種血清蛋白質(zhì)所帶靜電荷不同，而有不同的遷移率。表面電荷越多，則遷移快；反之則慢。因此各種蛋白質(zhì)按電荷少，分子量大小及分子形狀以一定的順序排列形成一個(gè)個(gè)區(qū)帶。不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)所具備的電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)大大提高了它的分辨率。1.2.3WesternblottingWestern免疫印跡，是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)。與Southern或Northern雜交方法類似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò) PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。 該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。二、材料與方法2.1材料2.1.1表達(dá)載體與抗體大腸桿菌DH5a、一抗（BSA）、酶標(biāo)二抗2.1.2主要儀器高速離心機(jī)（D-37520,OsterodaamHarz）電子天平（JY2002，上海衡平儀器儀表廠）分析天平（AUY120,SHIMADZU）數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9240MBE，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）MJ-300BS-II霉菌培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）超速離心機(jī)（D-78532Tuttlingen,Hettich）恒溫振蕩器（CHA-S，國(guó)華企業(yè)）穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（JY-600PJ，北京君意東方）調(diào)速多用振蕩器（HY-4，國(guó)華電器有限公司）TY92-II超聲波細(xì)胞破碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）潔凈工作臺(tái)（等級(jí)：100級(jí)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備）美的電冰箱（美的集團(tuán)電冰箱制造有限公司）2.1.3主要藥品和溶液SPA基因的誘導(dǎo)表達(dá)1、5XM9鹽溶液（V=100ml）:在去離子水中溶解以下鹽類，終體積為100ml。Na2H2PO4?12H2O8.55gKH2PO41.5gNaCl0.25g(NH4)Cl0.5g2、LB培養(yǎng)基（固體培養(yǎng)基加1g瓊脂）：在去離子水中溶解以下物質(zhì)，終體積為100ml。TOC\o"1-5"\h\z胰蛋白胨 1g酵母提取液 0.5gNaCl 1g3、M9培養(yǎng)基：在750ml無(wú)菌水中(冷卻至50°C以下)加入下表試劑5*M9鹽溶液 200ml1mol/LMgSO4 2ml1mol/LCaCl2 0.1ml20%葡萄糖(細(xì)菌濾器除菌) 20ml2.1.2.2SDS、 2MTris-HCL(pH8.8),100mL稱取24.2gTris堿，加50mL蒸餾水，緩慢的加濃鹽酸至pH8.8(約加4mL),讓溶液冷卻至室溫，pH將會(huì)升高。加蒸餾水至100mL。2、 1MTris-HCL(pH6.8),100mL稱取12.1gTris堿，加50mL蒸餾水，緩慢的加濃鹽酸至pH6.8(約加8mL),讓溶液冷卻至室溫，pH將會(huì)升高。加蒸餾水至100mL。3、 10%(W/V)SDS,100mL稱取10g的SDS,加蒸餾水至總量100mL4、 50%(V/V)甘油，100mL量取50mL100%的甘油，加入50mL蒸餾水。5、 1%(W/V)漠酚藍(lán)，100mL稱取100mg漠酚藍(lán)加蒸餾水至100mL，攪拌直到完全溶解，過(guò)濾除去聚合的染料。6、 A液：丙稀酰胺儲(chǔ)存液，100mL30%(W/V)丙稀酰胺，0.8%(W/V)雙丙稀酰胺。稱取29.2g丙稀酰胺和0.8g雙丙稀酰胺加水至100mL7、 B液:4X分離膠緩沖液，100mL75mL2MTris-HCL(pH8.8)1.5M/L4mL10%SDS 0.4%21mL蒸餾水

8、C液：4X分離膠緩沖液，100mL50mL1MTris-HCL(pH6.8) 0.5M/L4mL10%SDS 0.4%46mL蒸餾水9、10%過(guò)硫酸銨，5mL0.5g過(guò)硫酸銨加到5mL蒸餾水，可在密封管內(nèi)，4C存放數(shù)月。10、電泳緩沖液，1L3gTris堿25mM14.4g甘氨酸192mM1gSDS0.1%加蒸餾水至1L,pH應(yīng)該在8.3左右。11、5X樣品緩沖液，10mL0.6mL1MTris-HCL(pH6.8)60mM/L50%(V/V)甘油25%2mL10%SDS2%0.5mL2-巰基乙醇14.4mM/L1mL1%漠酚藍(lán)0.1%0.9mL蒸餾水可在4°C存放數(shù)周，或在一20C保存數(shù)月。12、12%分離膠A液4mLB液2.5mL蒸餾水3.5mL10%過(guò)硫酸銨50pLTEMED5gL總量10mL13、兩塊5%堆積膠（6cmX8cmX0.75cm)，4ml蒸餾水2.3mlA液0.67mlC液1.0mlTOC\o"1-5"\h\z10%過(guò)硫酸銨 30gLTEMED 5gL14、 考馬斯亮藍(lán)染液，1L（過(guò)濾）考馬斯亮藍(lán)R—250 1.0g甲醇 450mL蒸餾水 450mL冰醋酸 100mL15、 考馬斯亮藍(lán)脫色液，1L甲醇 100mL冰醋酸 100mL蒸餾水 800mL16、 標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker2.1.2.3Westernblotting1、轉(zhuǎn)移緩沖液，500mlTOC\o"1-5"\h\z水 300mlTris 1.5015gGly 7.205g甲醇 100ml加水定容到500ml2、PBS緩沖液（pH7.4）,250ml水 200mlNaCl 2gKCl 0.05gNa2HPO4?12H2O 0.908gKH2PO4 0.06g用HCl調(diào)pH至7.4，加水定容到250ml3、封閉液，100ml，現(xiàn)配現(xiàn)用5%脫脂奶粉0.2%Tween-20的PBS緩沖液4、洗滌液，500ml0.2%Tween-20的PBS緩沖液5、 抗體稀釋液（同封閉液）6、 顯色劑DAB（二甲基聯(lián)苯胺）16mg30%H2O280ul加0.01mol/LTris-Hcl（pH7.2）至總體積20ml，新鮮配制2.2方法劃平板、挑單菌落及小搖過(guò)夜（LB-Amp+培養(yǎng)基）I20：1擴(kuò)大培養(yǎng)（M9-Amp+培養(yǎng)基）IIPIG、15°C誘導(dǎo)培養(yǎng)I離心收菌I破碎細(xì)胞I超聲波SPA的提取ISDSSPA的檢測(cè)、鑒定Westernblotting2.1.1SPA的表達(dá)1、 配置M9培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基2、 取重組菌，劃平板（LB-Amp+培養(yǎng)基），獲取單菌落。3、 挑取單菌落于試管（5mlLB-Amp+培養(yǎng)基）中，37C震蕩（小搖）過(guò)夜。4、 第二天擴(kuò)大培養(yǎng)，將5ml的菌液接種于100mlM9-Amp+培養(yǎng)基的錐形瓶中，在37C，150rpm振蕩的條件下擴(kuò)大培養(yǎng)。5、 將擴(kuò)大培養(yǎng)的菌種冰浴5分鐘，在15C，2000rpm的條件下振蕩培養(yǎng)45分鐘，然后再加入IPTG（終濃度0.8mmol/L）誘導(dǎo)，在15C，200rpm的條件下振蕩培養(yǎng)4天。6、將上述培養(yǎng)液4°C,8000r/min離心20min取沉淀，4°C貯藏備用。SPA的提取1、 取經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)的樣品A11mL置于EP管中，4C,12000r/min離心10min收集細(xì)菌沉淀，棄去上清；向沉淀中加入400UL水和100^5xSDS凝膠加樣緩沖液，重懸后煮沸10min，離心8min，取上清進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析2、 取經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的樣品A21mL置于EP管中，4C，12000r/min離心5min收集細(xì)菌沉淀，棄去上清；向沉淀中加入400以!水和100UL5xSDS凝膠加樣緩沖液，重懸后煮沸10min，離心8min，取上清進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。2.1.3破細(xì)胞收菌1、 將收集的菌體沉淀加20ml破碎緩沖液（pH8.0的lys緩沖液）在冰上混合45分鐘，如果pH7-8，需要用0.5MNaOH一邊攪拌一邊滴加.2、 把混合菌體在冰水中用超聲探頭破碎 3min,檢測(cè)pH,如果不在7-8,還是用0.5MNaOH一邊攪拌一邊滴加去調(diào).如果菌體的為50-500克，可以高壓破碎的方法，緩沖液同上，體積為1升，破碎三次，壓力為800bar.3、 破碎的液4度12000g離心20分鐘，這時(shí)候可以把上清和沉淀分別留樣，跑電泳，如果只沉淀中有目標(biāo)蛋白，那就用變性條件下去提取。2.1.4SDS-PSGE檢測(cè)表達(dá)的蛋白質(zhì)1、制備分離膠和堆積膠，依次緩慢倒入模具中，將梳子插入凝膠中，帶凝膠聚合，小心拔出，將凝膠放入電泳槽中，接好電極，把電泳緩沖液加入內(nèi)外電泳槽中，使凝膠沒(méi)入緩沖液中。3、 取蛋白質(zhì)樣品和5X樣品緩沖液混合置于EP管，100C水浴10分鐘，離心取上清液。（包括誘導(dǎo)前A］、誘導(dǎo)后A2、標(biāo)準(zhǔn)蛋白、上樣緩沖液）4、 用移液槍把樣液加入樣品空中，把蛋白質(zhì)樣品加入樣品孔的底部，同時(shí)加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白。5、 打開(kāi)開(kāi)關(guān)，開(kāi)始電泳，將電壓調(diào)制120v，條帶經(jīng)過(guò)分離膠時(shí)調(diào)制150v，漠酚藍(lán)流至底部時(shí)關(guān)閉電源。6、 取出凝膠，用小刀切去堆積膠。7、 戴上手套將凝膠移到大的培養(yǎng)皿中，倒入適量的染色液，置于搖床上震蕩40分鐘左右后，棄去染液，在水中漂洗，加入考馬斯亮藍(lán)脫色夜，震蕩過(guò)夜。Westernblottong1、 制備電泳凝膠，進(jìn)行SDSo2、 跑膠完畢后用小刀切膠條合適大小，用去離子水漂洗，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡5分鐘，平衡三次。3、 裁好與膠條形狀吻合的濾紙，海綿和NC膜沒(méi)入轉(zhuǎn)膜緩沖液30分鐘。4、 按負(fù)極碳板、海綿、三層濾紙、凝膠、PVDF膜、三層濾紙、海綿、陽(yáng)極碳板的順序放好，用玻璃棒滾動(dòng)去除氣泡。合攏轉(zhuǎn)移夾板并將平板兩側(cè)鎖住。5、 開(kāi)通電源，將電壓調(diào)至150V繼續(xù)電泳至漠酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部為止。6、 關(guān)閉電源，取出膜，用50mlPBST漂洗十分鐘。7、 在37°C下封閉三小時(shí)，倒出封閉液，用PBST漂洗三次，每次十分鐘。8、 與多克隆抗體反應(yīng)，37C振蕩2h，抗體稀釋比例1:40，用PBST漂洗3次，每次10min。9、 與酶標(biāo)二抗反應(yīng)，37C振蕩10min，抗體稀釋比例為1:200，用PBST漂洗3次，每次10分鐘。10、 放入顯色液，看到變色即刻拿出。11、 蒸餾水漂洗，終止反應(yīng)。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論3.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果

westernblotting將誘導(dǎo)后的A2經(jīng)電泳形成的凝膠切下轉(zhuǎn)移到NC膜上，將剩余的Marker蛋白，樣品A2及電泳緩沖液、轉(zhuǎn)移后的電泳帶做成像處理。得到SDS電泳帶（圖3-3）、轉(zhuǎn)膜后的電泳帶（圖3-4）、NC膜顯色帶（圖3-2）Marker蛋白2KD66.2KD43.0KDSPA-■已轉(zhuǎn)膜SPA-31.0KDKDKD圖3-4轉(zhuǎn)膜后的電泳帶圖3-2westernblotting 圖3-3SDS電泳帶圖3-4轉(zhuǎn)膜后的電泳帶3.2結(jié)果分析3.2.1SDS的分析1、 在31.0KD-43.0KD間A1和A2在同一直線上都有清晰的條帶（圖3—1如下箭頭所釋）。且A2的條帶較A］深，這說(shuō)明了IPTG產(chǎn)生作用，在一定程度上起到了誘導(dǎo)的作用，使菌體對(duì)該蛋白的表達(dá)量增加。2、 誘導(dǎo)后的條帶楫與誘導(dǎo)前的條帶Ai在31.0KD-43.0KD間有處于一條水平線上的電泳條帶（圖3-1），據(jù)文獻(xiàn)可判斷實(shí)驗(yàn)菌產(chǎn)生一種分子量跟SPA一樣的蛋白質(zhì)。初步猜測(cè)此處蛋白質(zhì)為SPA，為進(jìn)一步說(shuō)明，做westernblotting實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。3.2.2westernblotting的分析1、 SDS電泳帶（圖3-3）經(jīng)凝膠成像可清晰看到樣品A2產(chǎn)生一種分子量跟SPA2一樣的蛋白質(zhì)。2、 轉(zhuǎn)膜后的電泳帶（圖3-4）經(jīng)凝膠成像后無(wú)條帶，說(shuō)明在SDS電泳帶的A2條帶上的蛋白質(zhì)已完全轉(zhuǎn)移到NC膜上。3、 NC膜經(jīng)免疫印跡處理（一抗稀釋比例1:40、酶標(biāo)二抗稀釋比例1:200），顯色后清晰的出現(xiàn)了一條棕色條帶。4、 比較圖3-2、圖3-3、圖3-4在同一直線上的成像，綜合以上分析可知：誘導(dǎo)后的蛋白質(zhì)條帶與NC膜上免疫印跡之后的結(jié)果條帶相平齊，且在轉(zhuǎn)膜后的電泳帶的同一位置上無(wú)條帶，由此驗(yàn)證了該蛋白質(zhì)就是SPA，SPA基因已在大腸桿菌中得到成功表達(dá)。3.2.3綜述由以上可知：SPA基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)出了金黃色葡萄球菌蛋白A，誘導(dǎo)劑IPTG有明顯的誘導(dǎo)作用，經(jīng)試驗(yàn)SPA的提取、制備及鑒定得到證實(shí)。3.3實(shí)驗(yàn)討論3.3.1SDS的討論由圖3-1中的結(jié)果可以看出：1、 可看出標(biāo)準(zhǔn)蛋白、誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后的凝膠條帶基本清晰可見(jiàn)，2、 標(biāo)準(zhǔn)蛋白理應(yīng)只有六條清晰的條帶，但是據(jù)圖像上看，只能較為清晰的看到五條，而且在97.6-66.2KD及66.2-43.0KD之間有比較淡的條帶。推測(cè)原因.：①丙烯酰胺凝膠的聚合，通常是由化學(xué)過(guò)程完成的，丙烯酰胺的聚合的催化是過(guò)硫酸銨和TEMED，合適的催化系統(tǒng)必須不改變凝膠的緩沖條件，黏度和導(dǎo)電性，過(guò)硫酸銨和TEMED過(guò)量會(huì)引起電泳時(shí)的燒膠盒蛋白電泳帶的畸變，合適的配方使聚合過(guò)程要在較快時(shí)間內(nèi)完成；②在凝膠制成將封條撕掉時(shí)，可能造成了凝膠的局部微小移動(dòng)，在后期的跑膠時(shí)影響蛋白質(zhì)的通路。3、 實(shí)驗(yàn)注意問(wèn)題：注意每次使用完電泳槽后都要用洗潔精洗凈，模具上的殘留的凝膠會(huì)影響膠的凝固過(guò)程，影響膠的均勻性；電極緩沖液用過(guò)不能再利用，因?yàn)樗终舭l(fā)離子濃度會(huì)變高，會(huì)影響蛋白質(zhì)的活性，使電泳速度下降，條帶不清晰；做PAGE時(shí)，加過(guò)硫酸銨和TEMED加入后膠會(huì)很快凝固，膠要保證無(wú)氣泡，水封。拔梳時(shí)要緩慢、平穩(wěn)保證凹槽豎直，加樣量在15ul左右，防止外溢，以免孔與孔之見(jiàn)橫向影響，造成污染。westernblotting的討論1、 比較圖3-2與圖3-3,發(fā)現(xiàn)其高度不一致，這是由于在照相是沒(méi)有將兩者放在一起，在做完電泳后，經(jīng)照相后就直接丟了，沒(méi)有考慮到后期處理。這也是實(shí)驗(yàn)的大忌。2、 在圖3-3的SDS凝膠電泳成像帶上，人2處的條帶沒(méi)有圖3-1上A2處的條