微生態(tài)視角下肺與大腸相表皮菌群的差異

微生態(tài)視角下肺與大腸相表皮菌群的差異

“肺與結(jié)腸的內(nèi)外關(guān)系”是腸道理論的代表之一，其機制有待探索。課題組前期研究結(jié)果顯示,肺與大腸在黏膜免疫和神經(jīng)肽方面存在一定的相關(guān)性,部分揭示了“肺”與“大腸”相關(guān)的機制。為了進一步拓展對“肺”與“大腸”生理病理關(guān)聯(lián)的機制,本實驗從微生態(tài)學角度出發(fā),通過觀察肺部和腸道的菌群生長狀況,探尋“肺與大腸相表里”在微生態(tài)方面相互影響的機制。1材料和方法1.1男性,體重1.20%Wistar大鼠40只,SPF級,雄性,體重(180±20)g。購自成都達碩生物科技有限公司,實驗動物許可證號:SCXK(川)2008-15。1.2氫氧化鋁、芬諾酯片1%卵白蛋白(OVA,Sigma產(chǎn)品),氫氧化鋁(批號:20080807,成都市科龍化工試劑廠),復方地芬諾酯片(批號:09033001,焦作市博愛藥業(yè)有限公司)。1.3主要設(shè)備和設(shè)備超聲霧化器(WH-203型),厭氧培養(yǎng)箱(DY-Ⅱ型),隔水式需氧培養(yǎng)箱(SA-25型)。1.4大鼠的前向模型采用隨機數(shù)字表法將40只大鼠分為4組:空白對照組、肺病組(過敏性哮喘模型組)、腸病組(便秘模型組)和肺腸同病組(過敏性哮喘合便秘模型組),每組10只。肺病組模型制備及判定標準依據(jù)文獻,將OVA1mg和氫氧化鋁200mg溶于生理鹽水1ml中配制成凝膠致敏劑,第1天和第7天在大鼠雙側(cè)胸部、腹股溝共取4點各皮下注射0.15ml該致敏劑,同時腹腔注射0.4ml共計1ml進行致敏。14天開始將大鼠置于有機玻璃盒內(nèi),超聲霧化吸入1%OVA誘發(fā)哮喘(以大鼠出現(xiàn)煩躁、噴嚏、咳嗽、腹肌強烈收縮、呼吸急促等典型哮喘樣發(fā)作為標準),每天1次,每次30min,共計1周。腸病組模型制備根據(jù)文獻方法進行改進,將大鼠給予復方地芬諾酯片灌胃,劑量10mg/kg,隔天灌胃1次以保持大鼠持續(xù)的便秘狀態(tài)。造模后根據(jù)大鼠糞便的情況判斷模型是否成功,以糞便干燥、粒形縮短、排出費力,日排出量低于正常參考值范圍(4.28～11.18g)為診斷大鼠便秘的標準。肺腸同病組的制備,灌胃給予復方地芬諾片和注射致敏劑,具體方法同肺病組和腸病組。1.5細菌標本液的稀釋和培養(yǎng)最后1次霧化吸入次日的上午按摩大鼠腹部促進排便,將糞便置于滅菌研瓶內(nèi)搗碎,然后用無菌生理鹽水(0.85%)作對數(shù)稀釋。支氣管肺泡灌洗液的收集:10%水合氯醛麻醉大鼠,暴露氣管,插管,用0.02%PBS灌洗肺臟5～6次,收集灌洗液,以1500r/min離心5min,保存?zhèn)溆?。用稀釋液對樣本?0倍系列稀釋成不同稀釋度(10-2、10-3、10-4、10-5、10-6)的細菌標本液備用。真菌的培養(yǎng):移液器分別取0.1～0.2ml的已稀釋10倍的稀釋液涂抹于真菌培養(yǎng)基(沙堡弱培養(yǎng)基)表面,28℃培養(yǎng)3～5天觀察結(jié)果。細菌的培養(yǎng):移液器吸取不同稀釋度的細菌樣本稀釋液各20μl,滴于相應(yīng)選擇性培養(yǎng)基表面。每個稀釋度作3個平行樣,將已接種好的培養(yǎng)皿分別放入37℃需氧和厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～72h。嚴格無菌操作,確保無交叉污染。1.6菌落形成單位cfu數(shù)據(jù)分析菌落計數(shù):計數(shù)培養(yǎng)皿表面的菌落數(shù)并乘以稀釋倍數(shù),得到菌落形成單位(CFU)數(shù)據(jù)。由于數(shù)據(jù)較大,將此原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成對數(shù)值,完成統(tǒng)計運算。種類鑒定:根據(jù)細菌形態(tài)學、菌落、菌細胞和菌落形態(tài)、染色性及生化實驗鑒定。1.7統(tǒng)計方法采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析,計量數(shù)據(jù)以(xˉ±s)(xˉ±s)表示,組間比較采用單因素方差分析。2結(jié)果2.1大鼠菌群和細菌空白對照率的影響表1示,肺病組和肺腸同病組大鼠的菌群與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);腸病組大鼠菌群中的厭氧菌和真菌與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01);肺腸同病組大鼠的菌群與肺病組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),與腸病組比較差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01);肺病組與腸病組各菌群比較差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。2.2兩組大鼠菌群的比較表2示,3組大鼠的菌群與空白對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01);肺腸同病組大鼠的菌群與肺病組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01),而與腸病組比較,除需氧菌外,其他菌群差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01);肺病組與腸病組大鼠在需氧菌和厭氧菌方面差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。3肺腸同病對肺菌群的影響正常狀況下,機體與正常菌群之間保持著動態(tài)的微生態(tài)平衡,常駐菌與宿主的微環(huán)境形成一個相互依賴又相互作用的微生態(tài)系統(tǒng)。一旦這種微生態(tài)平衡受到破壞,就有可能導致機體疾病的發(fā)生。本次實驗結(jié)果顯示,在肺病狀態(tài)和腸病狀態(tài)下,大鼠的腸道菌群變化與正常狀態(tài)比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而在腸病狀態(tài)下,大鼠的肺部菌群變化與肺病狀態(tài)比較,差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01),說明腸病和肺病均對肺具有一定影響,但以肺病對腸的影響大。肺腸同病狀態(tài)下,大鼠的肺部菌群和腸道菌群變化均較單純的肺病和腸病顯著。由此可以看出臟腑間相互影響的程度具有一定的差異,臟病對腑的影響比較明顯,程度較大,而腑病對臟雖有一定影響,但相對較小。臟腑同病時,臟腑均發(fā)生明顯變化,比單純臟病或單純腑病更為嚴重?？梢?在肺與腸道病理狀態(tài)下,以及肺腸同病狀態(tài)下的菌群變化,在一定程度上似能為“肺與大腸相表里”的機制研究提供微生態(tài)