植物代謝組學(xué)研究進(jìn)展

植物代謝組學(xué)研究進(jìn)展

隨著系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展，科學(xué)生活研究進(jìn)入了后基因組時代，更加注重功能基因的研究。代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后出現(xiàn)的一門新學(xué)科,已成為后基因組學(xué)時代的一個非常重要的分支。20世紀(jì)90年代末,代謝組學(xué)的概念就已經(jīng)在微生物領(lǐng)域出現(xiàn),隨后Trethewey提出了代謝組學(xué)在植物領(lǐng)域的重要性。代謝組是指某一組織或者細(xì)胞在一特定生理時期內(nèi)所有低分子量的代謝產(chǎn)物(基因表達(dá)終產(chǎn)物),植物代謝組學(xué)則是對植物的某一組織或細(xì)胞在一特定生理時期內(nèi)所有低分子量代謝產(chǎn)物同時進(jìn)行定性和定量分析。它是以組群指標(biāo)分析為基礎(chǔ),以高通量檢測和數(shù)據(jù)處理為手段,以信息建模與系統(tǒng)整合為目標(biāo),從宏觀角度研究生物機(jī)體的生化變化,從而監(jiān)控或者評價基因功能。與微生物和動物相比,植物代謝物種類繁多,其中大部分次生代謝產(chǎn)物具有重要的生物學(xué)功能和商業(yè)價值,因而大量應(yīng)用在藥品、食品、抗氧化劑、香味劑和天然色素等方面。目前已知植物代謝產(chǎn)物達(dá)20萬種之多,僅擬南芥Arabidopsisthaliana就預(yù)測有超過5000種初級和次生代謝產(chǎn)物。相比之下,微生物僅有1500種代謝物,動物也只有2500種代謝物。當(dāng)然海量的植物代謝產(chǎn)物也為科學(xué)研究帶來了一定的困難。代謝組學(xué)為較為全面地研究植物復(fù)雜代謝過程及其產(chǎn)物,從而為分析植物次生代謝網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、限速步驟,解析細(xì)胞活動過程,以及尋找植物間的親緣關(guān)系等等提供了可能,同時也為闡明中草藥“黑箱體”,更好的評價中藥,為人類所用提供了一個良好的平臺。研究如此大量、復(fù)雜的化合物,需要依賴于先進(jìn)的實驗設(shè)備和數(shù)據(jù)分析方法的改進(jìn)。植物代謝組學(xué)進(jìn)行的是無差別代謝成分全分析,代謝物的數(shù)量和化學(xué)特性都是未知的,所以分析方法必須對較多的物質(zhì)有一定的靈敏度并且要避免忽視某種或某些特定的化合物。現(xiàn)在普遍應(yīng)用在植物代謝組學(xué)研究方面的分析技術(shù)有NMR,GC-MS,LC-MS,FTMS和CE-MS,然而它們在對特定化合物的分析或者靈敏度或者選擇性方面均有一定的局限性。高通量分析技術(shù)為研究紛繁復(fù)雜的植物次生代謝體系提供了可能,同時也產(chǎn)生了前所未有的海量數(shù)據(jù)。因此,如何利用統(tǒng)計學(xué)、生物信息學(xué)方法從海量數(shù)據(jù)中獲得有意義的信息已成為研究能否取得成功的非常重要的環(huán)節(jié)。目前常用的分析方法有多元回歸(multipleregression)、判別分析(discriminantanalysis)、主成分分析(principalcomponentanalysis)、聚類分析(hierarchicalclusteranalysis)、因素分析(factoranalysis)和經(jīng)典分析(canonicalanalysis)等等。分析技術(shù)和數(shù)據(jù)處理技術(shù)的快速發(fā)展將推動植物代謝組學(xué)迅猛發(fā)展。近年發(fā)展起來的多級聯(lián)用技術(shù)、UPLC等等都為植物代謝組學(xué)研究提供了巨大的推動力。將植物代謝分析的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)相結(jié)合將有利于建立基因和代謝產(chǎn)物之間的完整網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,從而為從基因、蛋白和代謝角度進(jìn)一步全面闡明植物代謝規(guī)律及其關(guān)鍵步驟打開了智慧之門。對于中藥研究來說,利用現(xiàn)代分析技術(shù),從不同層面深入闡明初級及其次生代謝產(chǎn)物,為開發(fā)中草藥打好基礎(chǔ)。對于中藥而言,可以利用植物代謝組的研究方法和思路對各原料藥有效成分進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測,從而克服采用不同原料藥材的中藥成品質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端,應(yīng)用現(xiàn)代代謝組學(xué)研究方法對道地藥材進(jìn)行指紋圖譜水平鑒別,嚴(yán)格控制中藥原藥材質(zhì)量。在現(xiàn)代中藥系統(tǒng)研究的指導(dǎo)思想上,建立符合多成分、多靶點、整體調(diào)節(jié)的中醫(yī)藥基本思想的研究方法,以現(xiàn)代技術(shù)進(jìn)行有效的科學(xué)表征。建立基于代謝組學(xué)思想的化學(xué)分析平臺得出的中藥組分各種指紋化圖譜(數(shù)據(jù)庫),作為通用的準(zhǔn)則搶占國際標(biāo)準(zhǔn)的制高點,將成為中藥現(xiàn)代研究的一個基本突破口。建立完善的標(biāo)準(zhǔn)組分庫是現(xiàn)代中藥創(chuàng)制的前提性基礎(chǔ)研發(fā)資源,魏陸海等認(rèn)為應(yīng)著重做好以下幾方面工作:建立符合GMP中藥生產(chǎn)的控制檢測(包括栽培、藥材分級和炮制加工)體系;建立生藥質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)體系;建立新藥研制與代謝圖譜庫;構(gòu)建優(yōu)質(zhì)、道地、珍稀中藥材DNA分子標(biāo)記與基因庫。而代謝組學(xué)在解決這些領(lǐng)域的問題時,有其他方法無法比擬的優(yōu)勢。1指紋圖譜技術(shù)代謝組學(xué)應(yīng)用的高靈敏度、高通量檢測技術(shù),可同時對大量代謝物進(jìn)行定性定量分析,較為全面地研究植物不同時期或者不同部位代謝物種類與含量變化,并進(jìn)一步通過這些變化來推測相應(yīng)的代謝途徑和代謝網(wǎng)絡(luò);也可用來研究不同生長環(huán)境對植物代謝的影響,從而對植物進(jìn)行分類,推測親緣關(guān)系。由于植物利用復(fù)雜的機(jī)制來維持體內(nèi)主要代謝物水平的相對穩(wěn)定,因此對植物代謝組的分析力求可檢測樣品中每種代謝物,這是進(jìn)行功能基因組學(xué)研究和植物質(zhì)量控制的基礎(chǔ)。Fiehn對筍瓜Cucurbitamaxima的葉柄脈管和葉片抽提物進(jìn)行GC-MS分析,得到了400多個峰,通過與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫比對,初步鑒定出90個化合物,并比較了葉柄與葉片之間在糖、氨基酸等代謝物組分方面的差別。Kim對3種麻黃植物Ephedra進(jìn)行了核磁氫譜指紋圖譜分析,通過主成分分析找到了它們之間的代謝物差異,證明指紋圖譜分析是植物化學(xué)分類學(xué)的一個有力工具,并為其全面質(zhì)量控制帶來了可能。中藥做為一個復(fù)雜成分體系,應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)對其進(jìn)行全面質(zhì)量控制,保證中草藥的藥效穩(wěn)定可靠性,可以歸屬為中藥指紋圖譜技術(shù)。一方面,針對中藥及其制劑產(chǎn)品進(jìn)行大量的指紋圖譜研究,建立系統(tǒng)的測定方法和全面的指標(biāo)控制參數(shù),通過和使得數(shù)學(xué)模型的建立,表征中藥的特性,表達(dá)成品的質(zhì)量,以達(dá)到對原藥材和工藝操作的質(zhì)量控制,達(dá)到指紋圖譜的可操作性、穩(wěn)定、量化的目的,提高中藥質(zhì)量控制的水平。另一方面,將傳統(tǒng)的植物化學(xué)純化分離技術(shù)與現(xiàn)代的基于色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對指紋圖譜中的指紋峰進(jìn)行系統(tǒng)的指認(rèn)和定量研究,尋找指紋特征和藥效的相關(guān)性,即“譜效關(guān)系”研究,探討指紋圖譜的生物等效性研究等,使指紋圖譜技術(shù)更加合理可靠的控制中藥質(zhì)量。因此,基于代謝組學(xué)思想的化學(xué)分析平臺得出的中藥成分指紋圖譜(數(shù)據(jù)庫),包括了體現(xiàn)藥效信息的多個有效部位的各種指紋圖譜,作為通用的準(zhǔn)則搶占國際標(biāo)準(zhǔn)的制高點,將更進(jìn)一步解決如何體現(xiàn)中藥和制劑的整體性和復(fù)雜性的難題,是中藥現(xiàn)代化研究的一個重要的突破口。2對優(yōu)良品種篩選的作用對突變型或者基因改造型植物的代謝變化和正常野生型的差異進(jìn)行比較,或者對組織培養(yǎng)得到的代謝產(chǎn)物與野生型之間的差異進(jìn)行比較,評價基因改造或者組織培養(yǎng)的效果、篩選優(yōu)良品種等有重要作用。隨著生物技術(shù)的進(jìn)步,這方面的研究將越來越廣泛。Murch采用HPLC-MS對黃芩Scutellariabaicalensis代謝成分進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)了2000個成分,并對其中的781個成分進(jìn)行鑒定,從而為篩選、評價優(yōu)良品種建立了篩選模型。Davuluri應(yīng)用代謝組學(xué)方法研究了基因改造西紅柿中與人體健康相關(guān)的成分類胡蘿卜素和解毒的黃酮類成分與野生株的差別,同時也用代謝輪廓的方法研究了來自葡萄的1,2-二苯乙烯基因的轉(zhuǎn)基因西紅柿中的新的解毒成分。Fukusaki應(yīng)用代謝組學(xué)研究方法,采用GC-MS從擬南芥中鑒定了48個成分,用多維統(tǒng)計方法研究了擬南芥葉和培養(yǎng)細(xì)胞T87的差別,確定了培養(yǎng)細(xì)胞T87的代謝物差異,證明了細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)勢。對于珍稀名貴中藥材,代謝組學(xué)提供了全面評價培養(yǎng)型和野生型之間的異同,篩選優(yōu)良品種等方法學(xué)平臺,為是解決資源匱乏中藥材提供了可能。3其他植物細(xì)胞代謝所謂監(jiān)測植物代謝產(chǎn)物,就是指通過外源化學(xué)藥品刺激、物理刺激或者生物刺激從而引起植物代謝產(chǎn)物的改變,通過代謝組學(xué)方法對這種變化進(jìn)行監(jiān)測與全面分析,找出差異,從而找到植物代謝的規(guī)律及其關(guān)鍵步驟。Hirai應(yīng)用HPLC-FTMS技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)硫磺和氮對擬南芥中芥子苷的代謝途徑具有重要影響,并顯示出相當(dāng)大的相關(guān)性。Broeckling在苜蓿細(xì)胞培養(yǎng)過程中加入生物和非生物的細(xì)胞誘導(dǎo)劑,觀察其對苜蓿代謝的影響,然后應(yīng)用GC-MS和LC-MS對苜蓿的代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測,結(jié)果表明許多初級代謝產(chǎn)物發(fā)生了顯著性變化,而這些初級代謝產(chǎn)物的改變量隨著其他初級代謝物對某種誘導(dǎo)劑的敏感而減小,從而證明代謝網(wǎng)絡(luò)中不同代謝產(chǎn)物之間具有相關(guān)性。以上研究均表明隨著外界條件的改變,植物體內(nèi)的代謝調(diào)節(jié)是一個相互作用的代謝網(wǎng)絡(luò)。同時也說明植物代謝組學(xué)對研究植物體內(nèi)復(fù)雜生理代謝物的波動是一種非常有效的方法。4叢枝菌根真菌共生的煙草根物質(zhì)譜圖目前主要應(yīng)用于共生過程和水果成熟過程的研究,通過對整個發(fā)展過程的代謝組學(xué)分析,找到該過程中的變化規(guī)律。Maier等研究了叢枝菌根真菌對煙草根部代謝的影響,對比了有叢枝菌根真菌共生的煙草根和沒有共生該真菌的煙草根的代謝物差異。HPLC-UV檢測結(jié)果表明有真菌共生的煙草根比無真菌共生的煙草根代謝物多了許多布盧姆醇衍生物,該文章也是首次對有叢枝菌根真菌共生的煙草根進(jìn)行研究。Aharoni等研究了番茄成熟過程中茄紅素等一系列代謝產(chǎn)物的動態(tài)變化過程,從而對番茄的成熟機(jī)制有了進(jìn)一步的了解,為加快番茄成熟速度打好了基礎(chǔ)。生理變化研究對于藥用植物而言,研究不同采收期植物有效成分的變化等生理變化過程,應(yīng)用現(xiàn)代科技驗證傳統(tǒng)中藥理論,是中藥現(xiàn)代化非常重要的一部分。5馬鈴薯斑塊的代謝組學(xué)研究為了闡明代謝途徑,首先應(yīng)用代謝組學(xué)的無偏分析技術(shù)系統(tǒng)研究并找出與某一代謝途徑相關(guān)的全部代謝物;然后進(jìn)一步證明該代謝途徑,應(yīng)找到與該途徑相關(guān)的一系列底物、中間產(chǎn)物和末端產(chǎn)物以及關(guān)鍵酶,并闡明該代謝途徑的調(diào)節(jié)機(jī)制和關(guān)鍵調(diào)節(jié)位點。Rolleston早在1972年就提出調(diào)節(jié)位點的底物和關(guān)鍵酶濃度將發(fā)生相反變化,用代謝組學(xué)手段則可以方便地找到調(diào)節(jié)位點。Tiessen等用HPLC對馬鈴薯塊莖進(jìn)行代謝組分析,同時檢測了馬鈴薯塊莖淀粉合成途徑中的一系列底物、中間物、酶及其產(chǎn)物含量的變化,然后通過對野生株和含有異源腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)轉(zhuǎn)基因株馬鈴薯進(jìn)行對比研究,提出了淀粉合成途徑中一種新的調(diào)節(jié)機(jī)制,即在離開母體情況下,馬鈴薯塊莖中淀粉合成關(guān)鍵酶AGPase的催化亞基AGPB會發(fā)生可逆的氧化還原反應(yīng)形成二聚體,使AGPase失活,從而抑制淀粉合成。研究紛繁復(fù)雜的中草藥次生代謝產(chǎn)物,提高活性成分的含量,就必須深入了解代謝途徑及其調(diào)控機(jī)制,才能正在從分子水平控制次生代謝物的合成方向,深入開發(fā)中藥。6馬鈴薯葉代謝特征代謝產(chǎn)物是基因表達(dá)的終產(chǎn)物,基因表達(dá)水平的極微小變化也可導(dǎo)致代謝物的大幅改變。以往通過可見的表型改變來判斷基因表達(dá)水平的升降,耗時較長,而且有時候基因表達(dá)變化無法引起表型改變,而此時植物體中某些代謝產(chǎn)物的含量卻已經(jīng)發(fā)生顯著變化。利用代謝組學(xué)方法檢測代謝物的變化則可以判斷基因表達(dá)水平的變化,從而推斷基因的功能及其對代謝流的影響。Urbanczyk-Wochniak等應(yīng)用GC-MS對馬鈴薯葉片的糖代謝物和其他初級代謝產(chǎn)物進(jìn)行了檢測,并且應(yīng)用基因芯片研究了馬鈴薯初級代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄基因。發(fā)現(xiàn)馬鈴薯葉子中的基因表達(dá)的變化與馬鈴薯代謝的顯著變化之間有較大的相關(guān)性,其中有56種代謝物質(zhì)發(fā)生了顯著性變化。晝夜變化過程中,雖然基因表達(dá)水平較低,但是馬鈴薯葉子中的糖代謝等都發(fā)生了顯著變化。這說明代謝產(chǎn)物可以放大基因表達(dá)的變化,從而在基因型和表現(xiàn)型之間的相關(guān)性研究中建立了一座橋梁。7轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究及其應(yīng)用基因組學(xué):基因代謝組學(xué)[將代謝輪廓分析與數(shù)量性狀基因座quantitativetraitlocus(QTL)分析結(jié)合]是鑒定控制代謝產(chǎn)物基因座的新工具。目前這方面的研究僅限于模式植物。Morreel應(yīng)用基因代謝組學(xué)對模式植物——楊屬植物黃酮類成分的生物合成途徑進(jìn)行研究,確定了美洲黑楊14種黃酮類成分的生物合成途徑,并且用QTL分析確定了生物合成途徑中的關(guān)鍵調(diào)控步驟的基因。Keurentjes應(yīng)用LC-TOFMS技術(shù)首次對擬南芥進(jìn)行了無偏向的基因代謝組學(xué)研究。該研究檢測到2000個質(zhì)譜峰,并對其中75%質(zhì)譜峰進(jìn)行了QTL識別。應(yīng)用該方法,他們不但發(fā)現(xiàn)了擬南芥中新的代謝途徑,而且還研究了不同地域及其親緣關(guān)系的擬南芥的代謝網(wǎng)絡(luò)與其基因網(wǎng)絡(luò)之間的關(guān)系,開創(chuàng)了植物基因代謝組學(xué)的先河。Nicolas對野生和突變的西紅柿進(jìn)行了全面代謝輪廓分析和功能基因的分析,檢測到與西紅柿營養(yǎng)相關(guān)的代謝物基因50%和QTL識別相關(guān)。根據(jù)得到的基因代謝輪廓對西紅柿不同株進(jìn)行分類,并且揭示了與顯性相關(guān)的代謝產(chǎn)物和與顯性不相關(guān)的代謝物。轉(zhuǎn)錄組學(xué):在這方面,模式植物的研究報道比較多。Hirai等利用FT-MS對擬南芥葉和根進(jìn)行無目標(biāo)代謝組分析,檢測到了大約2000個代謝物,同時又用HPLC-MS對擬南芥的糖類、氨基酸類進(jìn)行目標(biāo)代謝組分析。然后基于微陣列方法mRNA分析技術(shù)檢測到了21500個轉(zhuǎn)錄物,應(yīng)用BL-SOM數(shù)據(jù)分析技術(shù),將轉(zhuǎn)錄組和代謝租的數(shù)據(jù)進(jìn)行整合,推測出與擬南芥糖代謝相關(guān)的調(diào)控基因。Ferrario-Mery等研究了煙草中關(guān)于碳氮的代謝途徑,整合了該代謝路徑中轉(zhuǎn)錄組、酶活性及代謝組學(xué)的相互關(guān)系。通過對NH4+代謝過程中主要代謝物的定量分析,并整合先前關(guān)于氮在轉(zhuǎn)錄方面的知識,分析了谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase)在氮代謝過程中的作用,得到結(jié)論是代謝物量的變化與轉(zhuǎn)錄水平無關(guān),而與轉(zhuǎn)錄后修飾調(diào)節(jié)有關(guān)。對于非模式植物來說,由于基因組全序列信息及其相關(guān)數(shù)據(jù)庫的缺乏,因此基于微陣列方法(模式植物常用)的轉(zhuǎn)錄組分析是相當(dāng)困難的。因為這種方法需要前期的大量EST數(shù)據(jù)庫或cDNA文庫知識,或者需要大量的資金和人力投入。cDNA-AFLP是由AFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism)衍生而來的一種RNA指紋識別技術(shù),該方法不需要先前的基因序列知識即可對基因進(jìn)行鑒別,提高基因表達(dá)水平的定量信息,更為重要的是還可以對新基因進(jìn)行鑒定。Rischer建立了長春花中吲哚生物堿類生物合成途徑的代謝基因網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),用cDNA-AFLP轉(zhuǎn)錄輪廓分析技術(shù)(Transcriptprofiling)確定了178個代謝峰與417個基因標(biāo)簽之間的關(guān)系。該系統(tǒng)揭示了不同誘導(dǎo)劑對長春花吲哚生物堿代謝的影響,同時也揭示了一系列與長春花吲哚生物堿類的生物合成相關(guān)的代謝物和基因。蛋白質(zhì)組學(xué):DNA→mRNA→蛋白質(zhì)→代謝產(chǎn)物是生物信息的流動方向,與之相對應(yīng)的蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)是一個有機(jī)的整體,將所獲得的相關(guān)信息聯(lián)系起來,將有利于從整體水平研究生物系統(tǒng)對基因或環(huán)境變化的響應(yīng),從而更加準(zhǔn)確地判斷代謝物的變化是從哪一個層面發(fā)生的。Jean-EmmanuelSarry等通過鎘對擬南芥細(xì)胞的影響,測定不同時間點擬南芥代謝物輪廓和蛋白質(zhì)組的變化,并將代謝輪廓和蛋白質(zhì)組整合,從而闡明鎘對擬南芥代謝物的影響與6個不同家族的植物絡(luò)合肽蛋白相關(guān)。8人體-疾病-中藥的互聯(lián)互通隨著新的分析檢測技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展,代謝組學(xué)作為一個研究平臺,為植物代謝研究提供了全面、多維的視角,從而為