超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在代謝組學(xué)中的應(yīng)用

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在代謝組學(xué)中的應(yīng)用

代謝組學(xué)是經(jīng)過基因組學(xué)、轉(zhuǎn)換組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后出現(xiàn)的系統(tǒng)生物學(xué)的另一個重要分支學(xué)科。這是一個定量和分析生物內(nèi)源性代謝物質(zhì)的一般狀況以及內(nèi)外環(huán)境變化的規(guī)律性科學(xué)。代謝組學(xué)通過測量細(xì)胞、組織和機(jī)體代謝產(chǎn)物的濃度變化來反映基因、蛋白質(zhì)和代謝活性本身的直接關(guān)系。由于代謝組學(xué)變化是機(jī)體對基因、疾病、環(huán)境和藥物等作用的最終反映,其內(nèi)源性代謝產(chǎn)物是機(jī)體一系列生命事件的關(guān)鍵或終點反應(yīng),因此,代謝組學(xué)可以幫助人們更好地了解生物體中各種復(fù)雜的相互作用及其本質(zhì)。臨床診斷、藥物開發(fā)、營養(yǎng)科學(xué)以及其他生命科學(xué)都會從代謝組學(xué)的研究中大大受益。目前,盡管代謝組學(xué)研究正處在最“熱”的時期之一,并且取得了許多重要成果,但其研究技術(shù)方法仍然是影響代謝組學(xué)迅速發(fā)展的瓶頸之一。代謝組學(xué)技術(shù)主要是借助全面系統(tǒng)的物質(zhì)分析平臺來描述體內(nèi)大量物質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)和豐度信息,其主要研究對象是相對分子質(zhì)量1000以下的內(nèi)源性小分子。早期的代謝組學(xué)研究方法主要采用核磁共振(NMR)技術(shù),NMR的主要優(yōu)點是測定條件溫和,不改變樣品的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì),還可通過施加外界干擾對樣品的變化進(jìn)行動態(tài)測定等。另外,1HNMR對含氫代謝產(chǎn)物具有一定的普適性。但是,相比較之下,色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),特別是高分辨質(zhì)譜憑借其普適性、高靈敏度和特異性的特點,逐漸成為代謝組學(xué)研究的主流技術(shù)。隨著超高效液相色譜(UPLC)分離技術(shù)和傅里葉變換-離子回旋共振-質(zhì)譜(FT-ICR-MS)檢測技術(shù)的迅猛發(fā)展和廣泛應(yīng)用,LC-MS聯(lián)用技術(shù)的優(yōu)勢也更加明顯,所以基于LC-MS的代謝組學(xué)方法不論在植物、微生物還是動物組織樣品領(lǐng)域都起著越來越重要的作用?；贚C-MS的代謝組學(xué)分析工作流程一般可包括:樣品采集、多組LC-MS數(shù)據(jù)的采集和獲取、數(shù)據(jù)預(yù)處理、多變量數(shù)據(jù)分析、標(biāo)志物識別和代謝關(guān)鍵節(jié)點和途徑分析等。本文綜述了基于LC-MS技術(shù)的代謝組學(xué)研究流程和進(jìn)展,并對其主要發(fā)展方向做了簡要展望。1生物樣品的采集和預(yù)處理方法。生物代謝樣品的采集與制備是代謝組學(xué)研究的初始步驟也是最重要的步驟之一。代謝組學(xué)研究需要嚴(yán)格的實驗設(shè)計和較高的分析精度,首先需要采集足夠數(shù)量的樣本,從而有效減少源于生物樣品(如血液、尿液、組織和細(xì)胞培養(yǎng)液等)個體差異對分析結(jié)果的影響,得到有統(tǒng)計學(xué)意義的分析數(shù)據(jù)。實驗設(shè)計中對樣品收集的時間、部位、種類和樣本群體等應(yīng)給予充分考慮,如以小鼠為研究對象時,需要考慮小鼠的品系、品種、性別、體重以及是否同窩等諸多因素的影響。此外,分析過程要有嚴(yán)格的質(zhì)量控制,需要考察如樣本的重復(fù)性、分析精度、統(tǒng)一設(shè)置空白樣本等。由于代謝產(chǎn)物的變化對分析結(jié)果有較大的影響,因此,在處理生物樣本時要特別注意避免由于殘留酶活性或氧化還原反應(yīng)而降解代謝產(chǎn)物或產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物。生物樣品采集后需要立即進(jìn)行生物反應(yīng)滅活處理,即對所收集樣品進(jìn)行快速淬滅,滅活的方法很多,如在液氮或-80℃下冷凍、酸堿處理或加有機(jī)試劑處理等。根據(jù)研究對象、目的和采用的分析方法不同,所需的樣品提取和預(yù)處理方法也各異。但在整個樣品處理和分析過程中,應(yīng)盡可能保留和體現(xiàn)樣品中代謝物的信息?；贜MR的代謝組學(xué)方法,樣品的預(yù)處理比較簡單,一般只需離心取上清液、加緩沖鹽溶液稀釋或者加有機(jī)試劑(如甲醇、乙腈等)沉淀蛋白即可。與NMR樣品相比,采用基于LC-MS的方法進(jìn)行“全”成分分析時,樣品處理方法比較復(fù)雜,很難有一種普遍適用的標(biāo)準(zhǔn)化方法。代謝產(chǎn)物通常用水或有機(jī)溶劑(如甲醇、己烷等)分別提取,獲得水提取物和有機(jī)溶劑提取物,從而把非極性相和極性相物質(zhì)分開,以便進(jìn)行特征分析。也可以選用合適比例的混合溶劑對水溶性和脂溶性的物質(zhì)同時進(jìn)行提取,黃強(qiáng)等在肝臟代謝組學(xué)的研究中發(fā)現(xiàn)甲醇和水(4:1)能實現(xiàn)最佳的提取效率和復(fù)溶結(jié)果。Teahan等用甲醇、氯仿和水的混合溶液對細(xì)胞中的代謝物進(jìn)行了較好的提取。對于代謝輪廓譜或靶標(biāo)分析,還需要做較為復(fù)雜的處理,如常用固相微萃取、固相萃取或親和色譜等預(yù)處理方法,一般可以根據(jù)目標(biāo)物的特性選擇合適的萃取小柱進(jìn)行樣品純化。為了避免代謝產(chǎn)物的降解,所有操作都需要在低溫條件下進(jìn)行。2質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用gc-ms數(shù)據(jù)采集是指運用LC和高分辨MS聯(lián)用技術(shù)檢測樣品中代謝產(chǎn)物的種類、含量、狀態(tài)及其變化,進(jìn)而得到代謝物譜或代謝指紋圖譜。由于生物體系中內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的復(fù)雜性,使得代謝組學(xué)技術(shù)分析對象的分子大小、數(shù)量以及其他理化參數(shù)差異很大,因此需要采集代謝產(chǎn)物的分析技術(shù)方法具有高靈敏度、高通量,甚至海量和無偏向性的特點。與其他組學(xué)技術(shù)只能分析特定類型的化合物不同,色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)兼?zhèn)淞松V的高分離度和高通量,以及MS的普適性、高靈敏度和特異性,因而成為代謝組學(xué)研究的最主要的分析工具之一。同時,根據(jù)現(xiàn)有的分析技術(shù)所具有的各自的優(yōu)勢和適用范圍,最好采用聯(lián)用技術(shù)和多種方法進(jìn)行綜合分析。相對于NMR靈敏度低、檢測動態(tài)范圍窄等弱點,MS具有較高的靈敏度和專屬性,可以實現(xiàn)對多個化合物的同時快速分析與鑒定。隨著色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展,越來越多的研究者將此技術(shù)用于代謝組學(xué)的研究。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)方法的主要優(yōu)點是有較高的分辨率和檢測靈敏度,儀器價格相對較低,并且有可供參考和比較標(biāo)準(zhǔn)的電子轟擊質(zhì)譜(EI-MS)譜圖庫,可以用于代謝產(chǎn)物定性和定量分析。但是,GC-MS不能直接得到體系中難揮發(fā)的大多數(shù)代謝組分的信息,對于揮發(fā)性較低的代謝產(chǎn)物需要進(jìn)行衍生化處理。相比較而言,LC-MS避免了GC-MS中繁雜的樣品前處理,且由于其較高的靈敏度和較寬的動態(tài)范圍,現(xiàn)已被越來越多地用于代謝組學(xué)的研究,尤其是非常適合于生物樣本中復(fù)雜代謝產(chǎn)物的檢測和潛在標(biāo)志物的鑒定。LC-MS的代謝組學(xué)研究通常采用反相填料、梯度洗脫程序,但體液樣品特別是尿樣,含有大量的親水性代謝產(chǎn)物,這些代謝產(chǎn)物在反相色譜上不保留或保留很弱。Cai等和Wang等使用親水反相色譜成功解決了血漿樣品中親水性物質(zhì)的弱保留問題。Hasegawa等和許國旺等研究了一個柱切換二維液相系統(tǒng),采用兩根液相色譜柱(反相色譜柱和親水色譜柱),通過閥切換實現(xiàn)了一次進(jìn)樣對復(fù)雜生物樣品中親水性和疏水性代謝產(chǎn)物的同時檢測問題。新的分析技術(shù)如超高效液相色譜-高分辨飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-TOF-MS)技術(shù)、毛細(xì)管液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(CLC-MS)技術(shù)、FT-ICR等也被用于代謝組學(xué)研究以提高代謝產(chǎn)物的檢測靈敏度和通量。理想的MS分析儀器不但要有高的分辨率(m/Δm>100000),還要能提供準(zhǔn)確的分子質(zhì)量(小于1ppm),同時還要能配合多種電離方式,如電噴霧離子化(ESI)、nanoESI、大氣壓化學(xué)電離(APCI)、基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)、大氣壓光電離(APPI)、AP-MALDI、EI/CI等。另外再配合UPLC的使用,通過減小色譜柱填料的粒徑,同時提高流動相的壓力,可以顯著提高樣品的分析時間和分離度,將UPLC與高分辨MS聯(lián)用可顯著提高代謝組學(xué)研究的效率。目前許多儀器廠商均推出了各自的整套代謝組學(xué)液質(zhì)聯(lián)用設(shè)備,通過與其自帶的軟件配合,可大大減輕代謝組學(xué)研究工作者的工作量。3代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)處理代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)分析與處理是指使用多變量數(shù)據(jù)分析方法對獲得的多維復(fù)雜數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理和信息挖掘。由于代謝組學(xué)研究對象的復(fù)雜性,因此獲得的數(shù)據(jù)往往都非常復(fù)雜,由此造成的數(shù)據(jù)分析處理技術(shù)一直是代謝組學(xué)研究的難點和瓶頸之一。代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)處理主要包括原始數(shù)據(jù)的預(yù)處理和多變量數(shù)據(jù)分析兩個步驟,其目的在于揭示生物樣品的關(guān)鍵性生物標(biāo)志物、代謝節(jié)點和代謝途徑,以最終幫助解釋代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)分析結(jié)果。目前,發(fā)達(dá)國家的實驗室已經(jīng)成功解決了困擾MS代謝組學(xué)研究的一些瓶頸問題,從而加快了從高通量樣品分析到完成海量數(shù)據(jù)分析的整個研究過程,基本可以完整地把整個平臺應(yīng)用于動物、植物、微生物、臨床醫(yī)學(xué)、藥物或營養(yǎng)科學(xué)等領(lǐng)域的項目研究中。3.1結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)預(yù)處理主要包括濾噪、峰識別、重疊峰解析、峰對齊、峰補(bǔ)齊、標(biāo)準(zhǔn)化和歸一化等。由分析儀器直接導(dǎo)出的數(shù)據(jù),一般不能直接用于統(tǒng)計分析,還需對數(shù)據(jù)進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換,將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為適合于多變量分析(主要是模式識別)的數(shù)據(jù)形式。在實際操作中,并不是每個步驟都需要進(jìn)行,而是根據(jù)實際情況的需要,可以選其中幾種進(jìn)行預(yù)處理操作。目前有關(guān)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件多達(dá)數(shù)十種,其中,常用的質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理軟件可分為3類:(1)免費分析軟件,如MSFACTS、MetAlign、XCMS和MZmine等。其特點是功能強(qiáng)大并且免費,但使用者需要一定的計算機(jī)背景知識和軟件知識基礎(chǔ)。如Scripp研究所開發(fā)的XCMS軟件是一種基于R語言的質(zhì)譜數(shù)據(jù)預(yù)處理工具,可處理多種公司生產(chǎn)GC-MS和LC-MS儀器所導(dǎo)出的格式為netCDF、mzXML或mzData等數(shù)據(jù)。由于XCMS支持多參數(shù)設(shè)置,所以在使用時可根據(jù)不同的需要進(jìn)行多參數(shù)優(yōu)化,并且XCMS還具有強(qiáng)大的圖形顯示功能,能夠把提取出來的潛在的生物標(biāo)志物的信號響應(yīng)強(qiáng)度在不同的組別中的差異直觀地顯示出來。(2)商品化軟件,如Markerlynx、AMDIS、MassHunter、Metalign和ChromaTOF等。其共同特點是功能強(qiáng)大,并且大多整合了相關(guān)搜索數(shù)據(jù)庫和統(tǒng)計分析軟件,可直接檢索代謝物的結(jié)構(gòu)并進(jìn)行統(tǒng)計分析,為使用者提供了很大的方便,如Markerlynx就整合了統(tǒng)計軟件UmetricsSimca-P和數(shù)據(jù)庫ChemSpider。其缺點是價格昂貴,并且只能與一定的儀器設(shè)備兼容。(3)可自主開發(fā)設(shè)計的編程軟件,如美國的Matlab軟件。自編軟件的特點是可根據(jù)自己的需要,設(shè)計編寫出一套非常適合自己使用的數(shù)據(jù)處理軟件,并且可以實現(xiàn)多種功能。如澳大利亞RMIT大學(xué)的Adams小組和浙江大學(xué)程翼宇研究組都自主編寫了相關(guān)程序用于各自的代謝組學(xué)研究。其缺點是使用者需要具備一定的軟件編程知識,對于初學(xué)者不易上手。綜上分析,這三類分析軟件都有自己的特點,可以滿足不同使用者的需求。在代謝組學(xué)中廣泛應(yīng)用的信號濾噪技術(shù)是正交信號校正技術(shù)(OSC)。與普通的譜圖濾噪技術(shù)不同,OSC濾掉與類別判斷正交(不相關(guān))的變量信息,只保留與類別判斷有關(guān)的變量,從而使類別判別分析能集中在這些與類別的判別相關(guān)的變量上,提高判別的準(zhǔn)確性。如基于LC-MS聯(lián)用的代謝組學(xué)方法,流動相組成的微小變化、梯度的重現(xiàn)性、柱溫的微小變化及其柱表面的狀態(tài)變化而導(dǎo)致的保留時間的差異都可由OSC進(jìn)行過濾。峰識別過程一般由電腦計算完成,主要依據(jù)信噪比進(jìn)行有效峰和背景噪音的響應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行對比篩選,根據(jù)不同條件可設(shè)置不同的信噪比值。色譜圖中所有峰信息識別完成后,需對譜圖實行對稱峰對齊,使相同的代謝產(chǎn)物在生成的數(shù)據(jù)矩陣中由同一個變量表示,使各樣本的數(shù)據(jù)盡量得到正確的比較。由于保留時間的重復(fù)性問題,HPLC中的峰匹配要相對困難。XCMS創(chuàng)新性地使用了非線性擬合保留時間校正法,這種方法通過一種特殊的算法將同一標(biāo)志物在不同樣品中的保留時間進(jìn)行歸一化處理,算出保留時間之間的偏差,進(jìn)而對物質(zhì)在所有樣品中的保留時間進(jìn)行校正,有效地解決了LC-MS聯(lián)用中出現(xiàn)的保留時間漂移問題。經(jīng)過數(shù)據(jù)的預(yù)處理后,最后得到的用于模式識別的數(shù)據(jù)為二維矩陣數(shù)據(jù)形式,其中,行代表樣品或?qū)嶒灁?shù)目,列則表示相應(yīng)的單個測定指標(biāo)(通常為相對分子質(zhì)量、保留時間和代謝物的信號強(qiáng)度等)。3.2數(shù)據(jù)分析中主成分回歸模型經(jīng)過一系列步驟的數(shù)據(jù)預(yù)處理后,代謝組學(xué)研究得到的仍然是大量多維的數(shù)據(jù)信息。為了充分挖掘所獲得數(shù)據(jù)中的本質(zhì)和潛在信息,對數(shù)據(jù)的分析需要應(yīng)用一系列化學(xué)計量學(xué)方法如多變量分析方法(MVA)來處理。根據(jù)研究對象和目的不同,代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)處理主要涉及4個層次:代謝物靶標(biāo)分析、代謝物輪廓(譜)分析、代謝指紋分析和代謝組學(xué)。應(yīng)用最多的是代謝指紋分析,即從檢測到的代謝產(chǎn)物信息中進(jìn)行兩類(如缺氧預(yù)適應(yīng)前后小鼠的狀態(tài))或多類(如不同表型間代謝產(chǎn)物)的判別分類,以及生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。數(shù)據(jù)指紋分析過程中應(yīng)用的主要手段為模式識別技術(shù),包括非監(jiān)督學(xué)習(xí)方法和有監(jiān)督學(xué)習(xí)方法。非監(jiān)督學(xué)習(xí)方法主要有主成分分析(PCA)、非線性映射和聚類分析等。有監(jiān)督學(xué)習(xí)方法主要是基于PCA、偏最小二乘法(PLS)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的改進(jìn)方法,常用的有類模擬軟獨立建模和偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)。作為非線性的模式識別方法,人工神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)(ANN)技術(shù)也得到廣泛應(yīng)用。目前應(yīng)用得較為廣泛的模式識別軟件為SIMCA-P+,其對其他軟件導(dǎo)出的數(shù)據(jù)格式都有很好的兼容性。SIMCA-P+軟件利用PCA和PLS-DA這兩種代謝組學(xué)研究中最常用的模式識別方法,對數(shù)據(jù)集的分類信息、溢出值和趨勢走向信息等進(jìn)行判斷。得到的主成分是由具有相關(guān)性的原始變量通過線性組合得到的相互正交的新變量,這些新變量包含了原始數(shù)據(jù)的大部分信息,一般只需要兩三個主成分就能提供原始數(shù)據(jù)80%以上的信息。偏最小二乘回歸與主成分回歸的不同之處在于得分因子的提取方法不同,簡而言之,主成分回歸產(chǎn)生的權(quán)重矩陣W反映的是預(yù)測變量X之間的協(xié)方差,偏最小二乘回歸產(chǎn)生的權(quán)重矩陣W反映的是預(yù)測變量X與響應(yīng)變量Y之間的協(xié)方差。通常以得分圖(scoreplot)獲得對樣品分類的信息,載荷圖(loadingplot)獲得對分類有貢獻(xiàn)變量及其貢獻(xiàn)大小,從而用于發(fā)現(xiàn)可作為生物標(biāo)志物的變量(圖1,圖2)。4代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜鑒定查詢數(shù)據(jù)庫的直接目的是為了解釋得到的質(zhì)譜信號,主要是根據(jù)代謝物的相對分子質(zhì)量和碎片結(jié)構(gòu)信息,從而推斷代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu);其次,一些功能數(shù)據(jù)庫還可以查詢到代謝物的生物功能、代謝節(jié)點和代謝途徑等信息。與基因組學(xué)和蛋白組學(xué)已有較完善的數(shù)據(jù)庫供搜索使用相比,目前代謝組學(xué)研究尚無類似的功能完備數(shù)據(jù)庫。一些數(shù)據(jù)庫只提供依據(jù)相對分子質(zhì)量進(jìn)行檢索代謝產(chǎn)物,這對實驗儀器設(shè)備提出了很高的要求,至少需要達(dá)到Q-TOF-MS和FT-ICR-MS的級別。另外,還有一些數(shù)據(jù)庫可以根據(jù)代謝產(chǎn)物的裂解碎片進(jìn)行檢索,但代謝產(chǎn)物在不同的實驗條件下,如離子源、轟擊能量、正負(fù)離子的選擇等可導(dǎo)致分子的碎片結(jié)構(gòu)有很大的差異,從而使確定代謝產(chǎn)物變得比較復(fù)雜。目前尚沒有哪個數(shù)據(jù)庫提供了完整的代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜碎片結(jié)構(gòu),因此,代謝組學(xué)中代謝產(chǎn)物或生物標(biāo)志物的質(zhì)譜信號的解釋工作還存在著較大的困難和不確定性。根據(jù)不同的用途和特點,有關(guān)代謝組學(xué)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫大致可以分為3類:(1)一般的化學(xué)數(shù)據(jù)庫,主要為天然或人工合成的化合物,如ChEBI、ChemFinder、ChemnetBASE、CSLS、EnhancedNCIdatabaseBrowser、Feihnlibrary、KEGGliganddatabase、MadisonMetabolomicConsortiumDatabase、MassBank、MerckIndex、NIST、PubChem、SDBS和SciFinder等;(2)有關(guān)解釋代謝產(chǎn)物和代謝途徑的數(shù)據(jù)庫,如BioCyc(HumanCyc和MetaCyc)、MMP等;(3)源自于特定項目研究的代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫,如Golm、HMDB、KNApSAcK、LipidMaps、LipidBank、Me