中國杜鵑屬植物根部真菌多樣性初步研究

中國杜鵑屬植物根部真菌多樣性初步研究

60%以上的世界杜鵑是中國的特產(chǎn)，尤其是分布在中國云南、四川和西藏的高山多年生杜鵑。許多品種是中國獨特的。它們是高山區(qū)生態(tài)系統(tǒng)中的建群種或伴生種,具有重要的生態(tài)價值。杜鵑花科植物分布廣泛,其根系普遍能與真菌形成一類特殊的菌根——杜鵑花類菌根,也稱歐石楠菌根(ericoidmycorrhizae,ERM)。近幾年,人們對杜鵑花類菌根的生物學和生態(tài)功能的研究越來越重視。研究表明菌根真菌的侵染對杜鵑花科植物的生長發(fā)育是有益的(Pearson&Read,1973)。一些杜鵑花類菌根真菌具有腐生營養(yǎng)能力,并能降解難以分解的物質,而且能在許多方面提高植物的適應性,如改善氮的吸收,提高對有毒金屬的抗性和土壤解毒能力(Cairney&Ashford,2002;Cairney&Meharg,2003)。另外,杜鵑花科植物的根系沒有根毛,吸收能力比具有根毛的根系小得多,杜鵑花科植物通過根系與真菌形成菌根(Smith&Read,1997),增強了對水分及營養(yǎng)的吸收能力(Lereau,1985)。人們早期發(fā)現(xiàn)的能和杜鵑花科植物形成杜鵑花類菌根的真菌都屬于子囊菌綱,包括柔膜菌目的真菌Rhizoscyphusericae(=Hymenoscyphusericae)(Zhang&Zhuang,2004)和它的無性階段Scytalidiumvaccinii(Pearson&Read,1973;Egger&Sigler,1993;Hambleton&Currah,1997),以及典型的杜鵑花類菌根真菌樹粉孢屬(Oidiodendron)真菌(Perottoetal.,1995,1996;Hambleton&Currah,1997;Monrealetal.,1999)。隨著分子技術的應用,人們開始利用rDNA序列研究內生真菌的遺傳多樣性和分類學地位,對杜鵑花類菌根真菌種類的認識越來越深入。例如,Bougoure和Cairney(2005)分離培養(yǎng)了澳大利亞的杜鵑花屬植物Rhododendronlochiae根部的菌根真菌,利用限制性片段多態(tài)性(RFLPs)和ITS序列及變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析,通過比較直接提取得到的DNA的真菌ITS序列和分離培養(yǎng)得到的真菌集合,最終得到了一系列杜鵑花類菌根真菌和非菌根真菌。我國西南是杜鵑花類植物分布中心,全面開展杜鵑花類植物菌根真菌多樣性研究,必將有助于理解植物與真菌共生關系對環(huán)境的適應及生物多樣性維持機制。為此,我們在四川省的中國杜鵑園選取兩種杜鵑花植物,采用直接擴增其根部真菌rDNA-ITS等分子手段研究了杜鵑花屬植物根部真菌的多樣性。1材料和方法1.1都江堰市創(chuàng)新生態(tài)地區(qū)的自然旅游資源實驗地點設在四川省的中國杜鵑園(30°44′00′′N,103°27′00′′E),海拔1,700–1,800m,位于川西平原向青藏高原過渡地帶的都江堰市西北30km的龍池地區(qū),處在三面環(huán)山的馬蹄形山間盆地內。成土母質為花崗巖,土壤為山地黃棕壤,氣候屬中亞熱帶濕潤性季風氣候。實驗地年平均氣溫8℃,年降雨量1,600–2,000mm。1.2發(fā)根、含土塊的發(fā)根分別隨機選取3株樹齡約20年的銀葉杜鵑(Rhododendronargyrophyllum)和繁花杜鵑(R.floribundum),找到最細的發(fā)根(hairroots)部分,在不同的位置上用枝剪小心剪下。將取到的發(fā)根同附著的土塊在水中浸泡約1h,用水小心沖洗干凈。將發(fā)根剪成約1cm長的根段,每種杜鵑花隨機取10個根段,分別放入100%的酒精中保存用于DNA提取。1.3pcr擴增和克隆采用改良的CTAB法(Guoetal.,2000),分別提取每個根段的基因組DNA進行檢測。采用巢式PCR的方法擴增真菌的內轉錄區(qū)(ITS),所用引物為內外兩對引物。第一輪ITS-PCR擴增引物為NSI1(5′-GATTGAATGGCTTAGTG-AGG-3′)和NLB4(5′-GGATTCTCACCCTCTATGA-C-3′)(Martin&Rygiewicz,2005)。PCR反應體系為50μL,含有2.0mMMgCl2,0.2mMdNTP(TaKaRaJapan),0.2μM引物,25mgBSA,2UTaq聚合酶(TaKaRa,Japan)和適量的模板DNA,加入去離子水補足至50μL。PCR反應程序:95℃預變性8min95℃變性30s,60℃退火40s,72℃延伸40s,共35個循環(huán);最后72℃延伸5min。反應過程中用去離子水做陰性對照。第二輪ITS-PCR擴增引物為ITS1-F(5′-CTTGG-TCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS4(5′-TCCTCC-GCTTATTGATATGC-3′)(Grades&Bruns,1993)。PCR反應體系為25μL,含有1.5mMMgCl2,0.2mMdNTP(TaKaRa,Japan),0.2μM引物,1.5UTaq聚合酶(TaKaRa,Japan),1μL第一輪ITS-PCR產(chǎn)物作為模板DNA,加入去離子水補足至25μL。PCR反應程序:94℃預變性5min,94℃變性40s,55℃退火40s,72℃延伸55s,共30個循環(huán);最后72℃延伸10min。引物序列由上海生物工程有限公司合成。ITS-PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)上進行電泳,用凝膠成像儀觀察。參考Renker等(2006)混合PCR產(chǎn)物克隆的方法將每種杜鵑花的10個ITS-PCR產(chǎn)物混合作為外源DNA,使用pEASY-T3CloningVector(TransGeneBiotech,China)進行克隆,用TOP10感受態(tài)細胞(TransGeneBiotech,China)進行轉化。從每一個克隆庫中隨機挑取100個克隆。每一個陽性克隆用引物ITS1-F和ITS4擴增ITS區(qū)域,將得到的ITS-PCR產(chǎn)物依次用限制性內切酶HinfI和AluI(TaKaRa,Japan)分別進行酶切。酶切片段在2%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測,用凝膠成像系統(tǒng)記錄譜帶圖像。挑選具有特異性的RFLP帶型的PCR產(chǎn)物進行ITS序列測定,測序由Invitrogen生物技術有限公司完成。1.4在真菌范圍內分析1.5種真菌間克隆數(shù)目的差異顯著性檢驗用Fisher’sExactTest(Clarksonetal.,1993)檢驗兩種真菌種類間克隆數(shù)目的差異,0.05作為差異顯著性檢驗的域值。2結果2.1水景菌綱類型銀葉杜鵑和繁花杜鵑的兩個克隆庫中,共得到197個克隆,其中92個來自于銀葉杜鵑根部,105個來自繁花杜鵑根部。經(jīng)過RFLP分析及測序,得到89個具有特異性RFLP帶型的克隆序列。相似度≥97%的序列被視為同一個分類單元,共得到41個真菌分類單元(表1)。其中24個屬于擔子菌綱,分別屬于:蠟殼耳目(Sebacinales)、傘菌目(Agaricales)、Erythrobasidiales和線黑粉菌目(Filobasidiales)4個目,17個屬于子囊菌綱真菌,分別屬于柔膜菌目(Helotiales)、散囊菌目(Eurotiales)、盤菌目(Pezizales)和假球殼目(Pleosporales)。通過與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列對比分析,發(fā)現(xiàn)所得到克隆中有40個為曾經(jīng)報道過的典型的杜鵑花類菌根真菌,占比例較大。其中有30個與子囊菌綱柔膜菌目的真菌R.ericae(AY394687,AM084704和AY394684)具有較高的相似度,9個與樹粉孢屬(Oidiodendron,Myxotrichaceae)真菌具有較高的相似度,1個與Cryptosporiopsis(皮盤菌科,Dermateaceae)真菌最相近。另外10個克隆與未能培養(yǎng)的杜鵑花菌根真菌AB089663和AB089660(Usuketal.,2003)以及在沙龍樹(Gaultheriashallon)根部得到的真菌AF300726(Allenetal.,2003)比對具有較高的相似度,這些都是曾報道過的分離于杜鵑花科植物根部但未能定名的真菌。在得到的其他子囊菌綱克隆中,有14個屬于青霉屬(Penicillium)真菌1個屬于擬青霉屬(Paecilomyces)真菌,這兩類真菌都屬于腐生營養(yǎng)的子囊菌綱種類。在本研究中分離得到的擔子菌綱真菌克隆也占有顯著的比例。共有41個克隆屬于蠟殼耳目,24個與傘菌目的口蘑科(Tricholomataceae)真菌最相近,還有一些克隆與Erythrobasidiales和線黑粉菌目的真菌具有較高的相似度?？傊?在兩種杜鵑的根部系統(tǒng)中,存在豐富多樣的真菌群落,包括典型的杜鵑花類菌根真菌、外生菌根真菌和一些其他類型真菌。2.2銀葉植物erythrobasiwelle的真菌克隆銀葉杜鵑和繁花杜鵑根部中出現(xiàn)的真菌主要類群相似。從表2可以看出,在銀葉杜鵑根部系統(tǒng)中,出現(xiàn)相對頻率最高的前3類真菌克隆屬于柔膜菌目、散囊菌目和蠟殼耳目;在繁花杜鵑根部系統(tǒng)中,出現(xiàn)相對頻率最高的前3類真菌克隆屬于傘菌目、蠟殼耳目和柔膜菌目。另外,在銀葉杜鵑和繁花杜鵑根部出現(xiàn)的不同真菌種類的相對頻率也不同(圖1)。經(jīng)Fisher’sExacTest檢驗,銀葉杜鵑根部的青霉屬、樹粉孢屬和擔孢酵母屬(Erythrobasidium)真菌的克隆,其相對頻率都極顯著高于繁花杜鵑(P<0.01)。而在繁花杜鵑中的傘菌目真菌的克隆相對頻率極顯著高于銀葉杜鵑中的克隆相對頻率(P<0.01)。3討論3.1蠟殼耳目真菌的分離和鑒定通過序列比對,我們發(fā)現(xiàn)子囊菌綱柔膜菌目的真菌種類在兩種杜鵑花根部中出現(xiàn)的相對頻率很高(表2)。且柔膜菌目物種很多,包括許多已經(jīng)報道過的杜鵑花類菌根真菌(Monrealetal.,1999;Berchetal.,2002;Vralstadetal.,2002)。其中R.ericaeaggregate和樹粉孢屬的Oidiodendronmaius分布最廣泛,也是被研究最多的杜鵑花類菌根真菌(Read1996;Straker,1996;Smith&Read,1997)。在本研究中,樹粉孢屬真菌出現(xiàn)的相對頻率較低,只出現(xiàn)在銀葉杜鵑中(圖1),而R.ericaeaggregate在兩種杜鵑花中出現(xiàn)的相對頻率都較高(圖1)。這一結果與在荷蘭和丹麥歐石楠荒野中生長的Callunavulgaris的根部真菌種類比例相似(Johansson,2001;Zijlstraetal.2005),他們分離得到的樹粉孢屬O.maius的頻率較低。然而,Usuki等(2003)在對日本赤松林(Pinusdensiflora)中生長的R.obtusumvar.kaempferi菌根的研究中,分離得到的樹粉孢屬真菌O.maius頻率卻很高。Sigler等(2005)報道,在美國西北部的杜鵑花科植物中出現(xiàn)了柔膜菌目的真菌Cryptospo-riopsisericae,Zijlstra等(2005)從杜鵑花科植物根部分離的Cryptosporiopsis種類占8%,而本研究中我們只在銀葉杜鵑中得到1個與C.ericae相似度達88.1%的克隆(表1),可以推斷它至少應為柔膜菌目的真菌。本研究結果表明蠟殼耳目真菌也是存在于銀葉杜鵑和繁花杜鵑根部的真菌(表2)。Weiss等(2004)曾通過系統(tǒng)發(fā)育分析將分離得到的蠟殼耳目真菌分為兩大分支,即CladeA和CladeB,主要區(qū)別在于它們的生態(tài)功能不同,CladeA形成EEM(ectendomycorrhizas),CladeB形成杜鵑花類菌根。Setaro等(2006)使用分子鑒定方法和超顯微結構分析,發(fā)現(xiàn)在厄瓜多爾南部生長的Cavendishianobilis根部的主要菌根真菌都屬于蠟殼耳目。本研究中得到的蠟殼耳目克隆與Selosse等(2007)在火紅杜鵑(Rhododendronneriiflorum)以及Epipactisplautris根部分離得到的蠟殼耳目真菌相似,而且這些真菌都屬于蠟殼耳目的CladeB。Selosse等(2007)研究表明,蠟殼耳目真菌是杜鵑花科植物常見的菌根真菌,從杜鵑花類菌根中分離得到的真菌序列,都聚集在CladeB中。雖然分支B中的蠟殼耳目真菌可能是杜鵑花根部重要的菌根真菌,但是仍然需要回接實驗來證明杜鵑花屬植物和蠟殼耳目真菌的共生關系。Zhang等(2009)發(fā)現(xiàn)云錦杜鵑(R.fortunei)菌根分離菌主要仍是子囊菌綱真菌,很少量屬于擔子菌綱,其中有一種擔子菌綱真菌可以通過回接實驗在云錦杜鵑的表皮細胞中形成菌絲卷狀的結構。由此看出部分杜鵑花類真菌,尤其是擔子菌綱真菌不容易通過分離培養(yǎng)獲得,但卻可以在直接提取毛根DNA時被發(fā)現(xiàn)。3.2外生菌根真菌和說本研究結果顯示銀葉杜鵑和繁花杜鵑的根部有典型的外生菌根真菌存在,其中傘菌目真菌在繁花杜鵑中占顯著優(yōu)勢(表2),包括口蘑屬真菌和被命名為未培養(yǎng)的外生菌根真菌(AY641466)(表1)。另外,蠟殼耳目真菌也能廣泛地與外生菌根植物形成外生菌根。在以前的研究中,人們認為外生菌根真菌和杜鵑花類菌根真菌屬于不同的類群(Smith&Read,1997),然而這種觀念在漸漸轉變。吳重華(2000)報道了在太白山自然保護區(qū)巴山冷杉下采到的與金背杜鵑(R.clementiae)共生的3種真菌:卷緣網(wǎng)褶菌(Paxillusinvolotes)、亞褐環(huán)粘蓋牛肝(Suillussubluteus)和黃粉牛肝菌(Pulverobololetusravenelii),這3種真菌都與金背杜鵑形成外生菌根。杜鵑花植物能與外生菌根真菌形成共生關系的生態(tài)學意義可能在于:常處于林下層的杜鵑花類植物,通過與外生菌根植物共生的同一種真菌菌絲體整合到森林的公共菌絲體網(wǎng)絡,從而成為森林內部以公共菌絲體網(wǎng)絡為中介的資源再分配活動的參與者。這可能對于它們適應多樣的生境具有較重要意義。3.3資產(chǎn)階段發(fā)生的變化本研究中,發(fā)現(xiàn)了擬青霉屬與青霉屬的真菌(表1),這兩個屬的真菌廣泛存在于土壤、腐殖質中屬于典型的腐生真菌。Bougoure等(2007)研究報道在蘇格蘭生長的杜鵑花科植物的根部也發(fā)現(xiàn)有Penicilli