超數(shù)排卵技術(shù)在綿羊生產(chǎn)中的應(yīng)用

超數(shù)排卵技術(shù)在綿羊生產(chǎn)中的應(yīng)用

所謂超數(shù)卵優(yōu)良率，是指在母牛發(fā)交周期內(nèi)適當(dāng)時(shí)間內(nèi)釋放激素，提高血液中激素的濃度，從而減少卵石中自然封閉的卵數(shù)。此外，更多的卵生長和卵位發(fā)育，也被稱為“超位”。是快速繁育優(yōu)質(zhì)種羊的有效途徑。1材料表面1.1水公養(yǎng)地種1人供體羊共70只:育成羊18只,其中無角陶賽特羊6只、白頭薩福克羊7只、特克塞爾羊5只;成母羊52只,其中東弗里生羊5只、無角陶賽特羊31只、白頭薩?？搜?0只、特克塞爾羊6只。這些母羊均膘情良好、發(fā)情正常、健康無繁殖疾病。飼養(yǎng)方式:為全年半放牧半舍飼的方式,試驗(yàn)期間以舍飼為主。精料組成:豆餅10%+玉米25%+食鹽0.3%+預(yù)混料2.7%。本試驗(yàn)在2008年10—11月份進(jìn)行。1.2激素和促排卵素釋放型陰道海綿栓:自制;CIDR:新西蘭哈密爾頓生物公司;孕馬血清促性腺激素(PMSG):1000IU/支,寧波市激素制品有限公司;垂體促卵泡素(FSH):100IU/支,寧波市激素制品有限公司;氯前列烯醇(cloporostenol):0.2mg/支,寧波市激素制品有限公司;促排卵素3號(hào)(LHRH-A3):20IU/支,寧波市激素制品有限公司;絨毛膜促性腺激素(HCG):100IU/支,寧波市激素制品有限公司;沖卵液:1000mL/袋,ICPbioLimited,Auckland,NewZealand;酒精、碘酒、生理鹽水、雙蒸水、新潔爾滅、青霉素、鏈霉素等。1.3手術(shù)治療改良志MoticSMZ-140體視顯微鏡、MoticSMZ-140體視顯微鏡:麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司制造;手術(shù)移植活動(dòng)保定車8臺(tái):自制;MICROLIGHT150型雙穿刺腹腔鏡:澳大利亞產(chǎn);移植針:澳大利亞Castell公司提供;常用手術(shù)等器械:國產(chǎn);二通式?jīng)_胚導(dǎo)管:澳大利亞Castell公司提供。2方法2.1體羊超處理和配體2.1.1超數(shù)排卵處理超數(shù)排卵處理方法:供體均采用新西蘭CIDR陰道分叉栓一次性埋植13d同期發(fā)情,撤栓前48h根據(jù)個(gè)體體重分別給予總劑量為255IU(體重71kg以上)、240IU(體重61~70kg)、225IU(體重51~60kg)、210IU(體重45~50kg)的FSH進(jìn)行超數(shù)排卵處理,每間隔12h肌肉注射一次,連續(xù)6次遞減注射,在注射第4次FSH的同時(shí)肌肉注射氯前列烯醇0.10mg/只,發(fā)情同時(shí)肌肉注射HCG500IU/只。2.2充卵液的回流和分離以發(fā)情開始的第1天記為0d,所有供體均于發(fā)情后第7天用手術(shù)法經(jīng)子宮回收胚胎。術(shù)前24h將供體單獨(dú)圈養(yǎng),停飼,空腹。手術(shù)器械等用0.15%的新潔爾滅溶液浸泡30min進(jìn)行常規(guī)消毒。術(shù)前將供體羊保定于手術(shù)移植車上,對供體進(jìn)行全身麻醉,術(shù)部剪毛消毒。手術(shù)時(shí)取頭低仰臥體位45~60°斜倒立保定法。手術(shù)部位于乳房下3~4cm腹中線處,以常規(guī)方法消毒、切口打開腹腔,借助腹腔鏡與子宮鉗翻動(dòng)卵巢系膜,觀察卵巢反應(yīng)及黃體情況并做記錄。對卵巢有反應(yīng)的供體用子宮鉗輕輕緩慢地將子宮角牽引到腹腔外,在一側(cè)子宮角基部用鈍鉗刺透子宮壁,插入沖卵導(dǎo)管,向沖卵管中打適量氣體,直到?jīng)_卵管的氣囊膨脹到適宜的程度可以保證沖卵液順利回流,在宮管結(jié)合部插入套管針,抽出針芯,并由此向子宮腔內(nèi)緩慢注入沖卵液。方法:先緩慢注入沖卵液20~25mL,再補(bǔ)注入空氣5~10mL,保證胚胎全部回收。用培養(yǎng)皿接收回流沖卵液,最后用手指輕輕壓擠子宮角,使沖卵液盡量回收完全,然后將沖卵管氣囊放氣,子宮角創(chuàng)口縫合。相同方法沖另一側(cè)子宮角,之后將子宮送回腹腔,用生理鹽水沖洗子宮。對手術(shù)部位進(jìn)行常規(guī)手術(shù)縫合、消毒。術(shù)后注射青霉素160萬IU,鏈霉素100萬IU,同時(shí)肌肉注射氯前列烯醇0.1mg,以消除供體的黃體,保證供體在下一情期提早發(fā)情。所回收的沖卵液立即送入21~26℃的無菌室,并在實(shí)體鏡下檢查吸取合格的胚胎,評定質(zhì)量,此時(shí)的受精卵在正常發(fā)育時(shí)應(yīng)處于桑椹胚至囊胚階段。對形態(tài)正常的胚胎在1h內(nèi)移入卵巢上黃體發(fā)育較好的受體羊子宮角內(nèi)。將胚胎分為A、B、C、D四個(gè)等級進(jìn)行鑒定,其標(biāo)準(zhǔn)是:A級胚胎:胚胎的形態(tài)正常,發(fā)育速度與胚胎日齡一致,卵裂球排列緊密適度,大小、色澤均勻,透明帶完整。B級胚胎:發(fā)育速度與胚胎日齡基本一致,卵裂球排列不太緊密輪廓清晰,個(gè)別分裂球大,透明帶完整。C級胚胎:分裂球排列松散輪廓不清晰,色澤過暗,有的破裂呈沙粒樣,有碎片;透明帶不完整等。D級胚胎:變性胚、退化胚。A、B級胚胎為可移植胚胎,C級胚胎常用于與A、B級胚胎搭配移植或直接舍棄,D級胚胎直接舍棄。分別將每只羊左右兩側(cè)卵巢上的黃體數(shù)、胚胎的發(fā)育階段、采胚數(shù)、可用胚數(shù)、變性胚數(shù)等作詳細(xì)記錄。2.3處理數(shù)據(jù)本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。3結(jié)果與分析3.1手術(shù)沖卵率及超排反應(yīng)率本試驗(yàn)共超數(shù)排卵處理70只供體。其中有1只成母羊沒有發(fā)情表現(xiàn),另有4只供體羊卵巢上沒有黃體只有卵泡,這5只供體羊沒有手術(shù)沖胚,其余65只均進(jìn)行手術(shù)沖卵,超排反應(yīng)率為92.86%(65/70)。所得平均黃體數(shù)8.65個(gè)(562/65),只均獲卵數(shù)4.88(317/65)枚,獲卵率為56.41%(317/562),只均獲可用胚數(shù)3.49(227/65)枚,卵可用率為71.61%(227/317),回收卵受精率為77.29%(245/317)。3.2不同藥物的負(fù)荷3.2.1手術(shù)沖卵結(jié)果試驗(yàn)1,用總劑量為210IU寧波產(chǎn)的FSH對無角陶賽特羊(6)、白頭薩?？搜?7)、特克塞爾羊(5)共18只育成供體羊進(jìn)行超數(shù)排卵處理。18只供體羊全部發(fā)情,但手術(shù)觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)有3只供體(Do、Su和Tx各1只)卵巢上沒有一級黃體只有未排卵卵泡,因此未沖卵,其余15只供體都進(jìn)行了手術(shù)沖卵。沖卵結(jié)果如下表1所示。由表1及圖1可以看出,用210IU寧波產(chǎn)FSH處理的3個(gè)品種間僅在卵回收率上Do顯著低于Su(P<0.05),極顯著低于Tx(P<0.01),而Su與Tx之間沒有顯著性差異(P>0.05)。卵巢上平均黃體數(shù)、可用胚數(shù)、受精卵率在三者之間均沒有差異(P>0.05);但Do的平均黃體數(shù)高于Su及Tx(6.25);Tx在卵受精率、平均可用胚數(shù)、平均卵回收數(shù)均高于Su和Do;Do的胚胎存活率則高于Su和Tx。3.2.2手術(shù)沖卵結(jié)果表1試驗(yàn)2,用總劑量為240IU寧波產(chǎn)FSH對東弗里生羊(5)、無角陶賽特羊(13)、白頭薩福克羊(10)、特克塞爾羊(6)共34只成母羊進(jìn)行超數(shù)排卵處理。34只供體羊全部發(fā)情,但手術(shù)觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)有2只供體(Su和Tx各1只)卵巢上沒有黃體或只有少數(shù)退化黃體及未排卵卵泡,因此未繼續(xù)沖卵,其余32只供體都進(jìn)行了手術(shù)沖卵。沖卵結(jié)果如下表2所示。由表2及圖2可見,在胚胎可利用率方面,Os與Do、Tx間差異顯著(P<0.05),而與Su(54.67%)間差異極顯著(P<0.01);Do、Su、Tx三者之間沒有顯著性差異(P>0.05)。在卵回收率方面:Su與Do、Tx間差異極顯著(P<0.01);Su與Os間差異顯著(P<0.05);Do與Os、Tx間沒有顯著性差異(P>0.05)。在卵受精率方面:Os(93.48%)與Do(65.08%)、Su(66.67%)、Tx(66.67%)間均差異極顯著(P<0.01);Do、Su、Tx三者之間沒有顯著性差異(P>0.05)。3.3超數(shù)排卵處理試驗(yàn)3,對18只無角陶賽特供體羊(Do)根據(jù)體重分別給予不同劑量的FSH藥物進(jìn)行超數(shù)排卵處理。給藥方法:在撤栓前48h根據(jù)個(gè)體體重分別給予總劑量為255IU(體重71kg以上)、240IU(體重61~70kg)、225IU(體重51~60kg)、210IU(體重45~50kg)的FSH進(jìn)行超數(shù)排卵處理,然后依據(jù)FSH劑量與體重的比值(IU/kg)分為3.4~4.0(第1組)、4.0~4.3(第2組)和4.3~4.6(第3組)3個(gè)組別。處理結(jié)果如表3。從表3的數(shù)據(jù)可見,體重與FSH的比值(IU/kg)從3.4~4.6的范圍內(nèi)對供體超排處理后的平均黃體數(shù)、卵泡數(shù)、卵回收率及可用胚數(shù)3方面均無顯著性差異(P>0.05),FSH劑量與體重比值在3.4~4.0范圍內(nèi)(第1組)時(shí)的平均卵回收數(shù)、平均可用胚數(shù)、平均受精卵數(shù)都高于4.0~4.3組(第2組)和4.3~4.6(第3組)組,但差異均不顯著(P>0.05)。4討論4.1采用寧波產(chǎn)fsh的劑量差異促性腺激素的使用劑量、種類、生產(chǎn)廠家及批號(hào)的不同都會(huì)影響到超數(shù)排卵的效果。常用的有澳大利亞、新西蘭及加拿大等國生產(chǎn)的激素制品及國內(nèi)寧波和中科院等單位的產(chǎn)品。據(jù)研究者報(bào)道,進(jìn)口激素的超數(shù)排卵效果要好于國產(chǎn)激素。如亓美玉用新西蘭產(chǎn)FSH與寧波產(chǎn)的FSH對72只德國肉用美利奴羊進(jìn)行超排處理,試驗(yàn)表明,回收卵受精率及可用胚率兩者間差異極顯著(P<0.01)。不同地區(qū)不同研究者用寧波產(chǎn)的FSH因所用劑量差異較大而超排結(jié)果也有一定的波動(dòng)。余文莉等在內(nèi)蒙古地區(qū)用寧波產(chǎn)FSH對綿羊進(jìn)行超排時(shí)發(fā)現(xiàn),各品種FSH總劑量均在150IU上下浮動(dòng),適宜范圍為120~180IU。張居農(nóng)等用寧波產(chǎn)FSH300IU取得了較好的效果。張鎖林等認(rèn)為,FSH劑量為240IU時(shí)的超排效果最好,可用胚平均數(shù)為26.2枚。宋慶偉等用寧波產(chǎn)FSH128~145IU對不同品種的肉用綿羊進(jìn)行超排處理,獲得平均可用胚6.23枚(691/111),可用胚率62.03%(691/1114)。王峰等用寧波產(chǎn)FSH120IU處理供體波爾山羊獲得可用胚數(shù)13.00枚±1.08枚。白喜云等報(bào)道,寧波FSH劑量在280IU以上時(shí)則卵巢上的卵泡數(shù)與黃體數(shù)在一定程度上呈正比例增加,但退化及未受精胚胎比率高達(dá)29.7%。劑量過小則起不到超數(shù)排卵的作用。其原因可能是每個(gè)超排處理的個(gè)體都有自身的生理環(huán)境,不同超排方案中各種措施及藥物間的綜合作用以及超排處理過程中各地區(qū)的氣候、光照等環(huán)境條件所引起的供體羊生殖內(nèi)分泌的不同及其對外源激素的敏感度不同。在本試驗(yàn)中用不同劑量的FSH對供體羊進(jìn)行超排處理結(jié)果變異較大,成母羊的平均卵回收數(shù)要高于育成羊,說明成母羊更適宜進(jìn)行超數(shù)排卵處理,育成羊最好不用于超數(shù)排卵。4.2相同時(shí)間不同品種羊肉的超排結(jié)果不同品種的個(gè)體其繁殖能力不同。Fernie等的試驗(yàn)結(jié)果表明,薩?？搜蚺c特克塞爾羊超排時(shí)的平均黃體數(shù)分別為9.5個(gè)±0.63個(gè)和8.4個(gè)±0.65個(gè),二者間差異不顯著(P>0.05)。張秀陶等對相同時(shí)間不同品種綿羊的超排結(jié)果進(jìn)行比較,得出黃體數(shù)和只均可用胚數(shù)依次為白頭薩?？搜?10.8個(gè)、7.5枚)、東弗里生羊(10.8個(gè)、3.6枚)、陶賽特羊(9.2個(gè)、4.3枚)、特克塞爾羊(8.8個(gè)、3.5枚)。說明不同品種的供體對激素的反應(yīng)變化不明顯。4.3對供體羊的選擇與用藥劑量的影響有研究表明,動(dòng)物體重范圍與所需藥物的劑量范圍有一定的相關(guān)性。對體重較小的供體,使用激素劑量過大時(shí)其卵巢反應(yīng)強(qiáng)烈,發(fā)育的卵泡以及未排卵卵泡顯著增多;對體重較大的供體,卵巢發(fā)育的卵泡較少,激素劑量過小則排卵卵泡明顯減少。因此,一般體重大的動(dòng)物應(yīng)適當(dāng)增加激素的劑量。高志英等用120IU寧波產(chǎn)FSH對德國肉用美利奴羊、無角陶賽特羊、特克塞爾羊3個(gè)品種的羊進(jìn)行超排處理,得出不同體重之間黃體數(shù)、回收胚胎數(shù)差異不顯著(P>0.05),但可用胚胎數(shù)以41~50kg組和51~60kg組為好,71~80kg組為最差,差異顯著(P<0.05);胚胎可用率41~50kg組顯著高于其他各組(P<0.01),51~60kg組和61~70kg組胚胎可用率顯著高于71~80kg組(P<0.01),61~70kg組胚胎可用率與71~80kg組差異顯著(P<0.05)。張鎖林等的研究結(jié)果表明,在35~70kg之間的不同體重羊進(jìn)行超排的效果差異不顯著(P<0.05)。本試驗(yàn)根據(jù)不同超排個(gè)體體重的高低給予不同劑量的FSH,結(jié)果顯示3組間的平均黃體數(shù)、卵泡數(shù)、卵回收數(shù)及可用胚數(shù)間均無顯著差異(P>0.05),但第1組的平均黃體數(shù)、卵回收數(shù)、可用胚數(shù)、可用胚率及卵回收率均高于其他兩組。本試驗(yàn)結(jié)