概況型花生果酒發(fā)酵酵母的篩選

概況型花生果酒發(fā)酵酵母的篩選

干旱科蠶科主要屬于紅景天和小樹，產(chǎn)于熱帶和亞熱帶地區(qū)。無花果又名奶漿果、隱花果,其果實(shí)皮薄而無核,軟甜可口,風(fēng)味郁香,口感甘甜,營養(yǎng)豐富。成熟無花果可食部分達(dá)90%。其含糖量在15~28%之間,富含人體必需的氨基酸、礦物質(zhì)和維生素,還含有大量的食物纖維、果膠、蛋白質(zhì)分解酶、脂肪酶等多種具有藥理價(jià)值的成分。研究表明,無花果含有抑制白血病的天門冬氨酸、治療冠心病的絲氨酸、抗癌的活性元素、抗衰老的超氧化物歧化酶等[4~7]。雖然無花果的營養(yǎng)價(jià)值和藥用醫(yī)療價(jià)值都很高,但由于其保鮮期短,常溫條件下1~2d即軟化、褐變、風(fēng)味下降以及腐爛,極大地影響了無花果的食用價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值,使無花果不能得到充分的利用。以無花果為原料生產(chǎn)果酒,不但可以提高無花果附加值,而且還可以解決賣果難的問題,促進(jìn)果農(nóng)的增收。利用發(fā)酵法將無花果制成果酒,既能保留無花果果酒的營養(yǎng)和藥用價(jià)值,又能延長其保存時(shí)間,是目前開發(fā)利用無花果的有效途徑之一。由于無花果果酒質(zhì)量、風(fēng)味參差不齊,制約了市場的占有率,不利于無花果果酒的發(fā)展。因此,提高無花果果酒的品質(zhì),滿足消費(fèi)者對(duì)無花果果酒需求,是目前亟待解決的問題。在無花果果酒發(fā)酵階段是形成其風(fēng)味和口感的關(guān)鍵環(huán)節(jié),直接影響無花果果酒的質(zhì)量,其關(guān)鍵因素是需要優(yōu)良的菌種,但目前尚無專門發(fā)酵無花果果酒的酵母菌,多采用葡糖酒釀酒酵母。本研究擬從無花果果皮和無花果果酒酒渣中篩選出酵母菌種,并研究其耐受性,篩選出最佳發(fā)酵菌種,對(duì)無花果果酒品質(zhì)具有重要意義。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料成熟的無花果:市售。無花果果酒酒渣:四川威遠(yuǎn)國友果業(yè)有限公司提供。1.2拉紅紅的制備富集培養(yǎng)基:葡萄糖5%、KH2PO40.25%、尿素0.1%、酵母膏0.05%、MgSO40.1%、Fe2(SO4)30.01%、孟加拉紅(1%的水溶液)0.023%,121℃滅菌15min。麥芽汁培養(yǎng)基:麥芽汁1000mL,加入瓊脂20g,溶化分裝后,121℃滅菌20min。YEPD培養(yǎng)基:酵母粉10g,蛋白胨20g,葡萄糖20g,蒸餾水1000mL,pH6.0,115℃滅菌20min。發(fā)酵培養(yǎng)基:新鮮無花果漿汁,用蔗糖調(diào)整糖度為18°Be,自然pH,115℃滅菌15min。1.3儀器、試藥和儀器GZ-250-HSH恒溫恒濕培養(yǎng)箱,韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司;BD-30生物顯微鏡,深圳市博視達(dá)光學(xué)儀器有限公司;WZ-103手持糖度計(jì),四川省成都市光學(xué)廠;UV2400紫外可見光分光光度計(jì),上海分析儀器總廠;LDZX-50FBS歷史壓力蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠;PX-A80T酒度計(jì),廣州市普析通儀器有限公司。1.4測試方法1.4.1母菌的豐富無菌條件下,準(zhǔn)確稱量無花果果皮和酒渣各1g,分別接種到酵母富集培養(yǎng)基中,于28℃振蕩培養(yǎng)24h。1.4.2菌種鑒定及初步鑒定在無菌條件下,將不同富集液進(jìn)行不同梯度稀釋,記錄并編號(hào)。選取適宜的稀釋度,涂布于平板,28℃倒置培養(yǎng)48h,根據(jù)菌落特征及鏡檢,初步確認(rèn)為酵母菌。挑取單菌落,在麥芽汁培養(yǎng)基平板上劃線直到單菌落,純菌株培養(yǎng)后于4℃條件下保藏,備用。1.4.3菌種的篩選培養(yǎng)一級(jí)篩選:將分離的菌株活化擴(kuò)大培養(yǎng)后,分別接種到含糖18%YEPD液體培養(yǎng)基中,于28℃振蕩培養(yǎng)7d,篩選酒香濃郁且伴有果香的菌株;二級(jí)篩選—杜氏管法:將活化的菌種,分別接種YEPD培養(yǎng)液中,附有杜氏管。在相同條件下,篩選出產(chǎn)氣快且多的菌株,重復(fù)三次;三級(jí)篩選:將活化的菌種,分別接種發(fā)酵培養(yǎng)基中,于28℃培養(yǎng)7d,測其酒精度和酸度,并結(jié)合感官評(píng)定,選出產(chǎn)酒精度較高,酸度和口感適宜的菌株。感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見文獻(xiàn),評(píng)定項(xiàng)目包括色澤、香味和滋味。1.5母菌的發(fā)酵性能1.5.1生長曲線測定將相同量菌種接種到不同pH值的無花果漿汁中,28℃搖床培養(yǎng)3d,每隔12h取樣測定波長600nm處吸光度值,觀察生長曲線的變化情況。1.5.2生長曲線測定將相同量菌種接種到不同糖度的無花果漿汁中,28℃培養(yǎng)3d,每隔12h取樣測定波長600nm處吸光度值,觀察生長曲線的變化情況。1.5.3生長曲線測定將相同量菌種接種到不同濃度SO2(添加不同量亞硫酸鈉)的無花果漿汁中,28℃條件下培養(yǎng)3d,每隔12h取樣測定波長600nm處吸光度值,觀察生長曲線的變化情況。重復(fù)三次。1.5.4生長曲線測定將菌種接種到不同酒精濃度的無花果漿汁中,28℃搖床培養(yǎng)3d,每隔12h取樣測定波長600nm處吸光度值,觀察生長曲線的變化情況。2結(jié)果與分析2.1菌落細(xì)胞形態(tài)觀察根據(jù)酵母菌的菌落特征和鏡檢結(jié)果[11~12],初步分離得到41株酵母菌。得到的菌落顏色為灰白色或乳白色,表面光滑、濕潤,質(zhì)地均勻,呈奶油狀的圓形或者橢圓形。在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),有圓形和卵圓形兩種,繁殖方式有產(chǎn)孢子和芽殖兩種。保留一端或兩端出芽生殖的菌株25株。2.2母菌的選擇2.2.1發(fā)酵液酒香味評(píng)價(jià)將分離得到的41株酵母菌分別接種到Y(jié)EPD培養(yǎng)基培養(yǎng)7d后,從感官評(píng)定,G3、G7、G8、G15、Z1、Z5、Z9、Z10、Z12、Z17、Z20、Z21等12株菌株的發(fā)酵液酒香味濃郁,且具有無花果的特殊香味,其他菌株發(fā)酵液有酸味、臭味、餿味等不愉快氣味。2.2.2酵母菌的生長情況將一級(jí)篩選得到的12株菌株作為杜氏管法篩選的出發(fā)菌株,接種到Y(jié)EPD培養(yǎng)液的試管中,然后放入杜氏管,28℃培養(yǎng)48h,杜氏管發(fā)酵試驗(yàn)的結(jié)果見表1。由表1可以看出,酵母菌在28℃培養(yǎng)48h能產(chǎn)氣達(dá)到或超過滿體積的酵母菌有6株。這些菌株生長旺盛,起酵能力較強(qiáng),可能有較高的發(fā)酵效率。其中,G7和Z1在發(fā)酵10h時(shí)產(chǎn)氣就已經(jīng)充滿杜氏管,起酵最快;Z21在發(fā)酵16h時(shí)產(chǎn)氣充滿杜氏管,起酵較快;Z12和Z20在發(fā)酵24h產(chǎn)氣達(dá)到杜氏管滿體積,起酵稍慢;Z10起酵較慢,發(fā)酵48h才充滿杜氏管。其余菌株發(fā)酵兩天仍未充滿杜氏管。故將在48h內(nèi)產(chǎn)氣達(dá)到或超過杜氏管滿體積的6株菌株(G7、Z1、Z10、Z12、Z20、Z21)作為下一級(jí)篩選的出發(fā)菌株。2.2.3不同菌株對(duì)無花果酒發(fā)酵的影響將二級(jí)篩選得到的6株菌株以5%的接種量接種入糖度為18°Be的無花果漿汁中,28℃發(fā)酵7d,每株菌做三個(gè)平行。發(fā)酵后感官評(píng)定各發(fā)酵液,并測定其酒精度和酸度,結(jié)果見表2。由表2可知,菌株Z20發(fā)酵的無花果酒香氣濃郁,酒精產(chǎn)率較高,果香宜人。根據(jù)綜合評(píng)定,Z20菌株較其他菌株更適合做無花果酒的發(fā)酵菌株。其他菌株的發(fā)酵液酒香果香較淡,口感酸澀,還伴有異味,因此不適合做無花果酒的發(fā)酵菌株。2.3目標(biāo)菌株的性能測試2.3.1ph對(duì)酵母菌生長的影響將Z20菌株接種于pH分別為3.0~5.0的無花果漿汁中,28℃培養(yǎng)3d,每12h取樣1mL,稀釋至5mL,測定吸光度,結(jié)果見圖1。由圖1可知,酵母菌Z20在pH為3時(shí)生長較緩慢,因?yàn)樵趐H較低時(shí),細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生應(yīng)急反應(yīng),致使細(xì)胞喪失生理活性,對(duì)細(xì)胞造成損傷。當(dāng)pH在3.5~5.0之間,菌體的生長隨pH的增加而加快,但整體較穩(wěn)定,因此酵母Z20在一定范圍內(nèi)具有耐酸性。2.3.2初始糖度對(duì)酵母菌生長的影響將Z20菌株接種到糖度分別為15~27°Be的無花果漿汁中,接種量為5%,28℃培養(yǎng)3d,每12h取樣1mL,稀釋至5mL,測定吸光度,測定結(jié)果見圖2。由圖2可知,當(dāng)初始糖度小于18°Be時(shí),隨糖度是我增加菌體的生長加快;當(dāng)初始糖度大于18°Be時(shí),隨著糖度的增加,糖度對(duì)菌體的抑制作用越明顯,這可能是因?yàn)樘呛吭黾?環(huán)境的滲透壓增大,對(duì)酵母菌細(xì)胞內(nèi)部主要代謝途徑中的酶的活性產(chǎn)生一定的影響。但隨著時(shí)間的增加,糖度對(duì)菌體的抑制作用減弱,當(dāng)菌體生長到48h時(shí),抑制作用基本消失。由此可知,酵母菌Z20的耐糖性較高。2.3.3so2對(duì)酵母菌生長的影響由圖3可知,當(dāng)SO2的濃度小于120mg/L的時(shí)候,酵母菌的生長基本不受影響,即SO2濃度在60~120mg/L的時(shí)候?qū)湍妇緵]有抑制作用;當(dāng)SO2的濃度超過120mg/L,酵母菌的生長隨SO2濃度的增加而減少,SO2在抑制雜菌生長的同時(shí)也抑制酵母菌的生長即SO2的抑制作用較強(qiáng)。則酵母菌Z20在一定范圍內(nèi)具有SO2耐受性。2.3.4酒精濃度對(duì)酵母菌生長的影響乙醇對(duì)酵母細(xì)胞本身來說,既是抑制劑又是毒素。果酒的酒精度一般在7~13%(V/V)之間,優(yōu)良果酒釀造酵母須具備一定的耐乙醇能力。將Z20菌種以5%的接種量接種入乙醇濃度為6~14%(V/V)糖度為20°Be的無花果漿汁中,28℃培養(yǎng)3d,每12h取樣1mL,稀釋至5mL,測定吸光度,結(jié)果見圖4。由圖4知,對(duì)于酵母菌Z20,當(dāng)酒精濃度小于12%vol時(shí)菌體生長隨酒精濃度的增加而變緩慢,但整體較穩(wěn)定,菌體受到的抑制