呼吸道病毒7項檢測試劑

上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司呼吸道病毒7項檢測試劑2011-1-10

呼吸道病毒7項檢測試劑目錄1．概述

②樣本完全風(fēng)干。③在20oC到25oC，用預(yù)冷的100%丙酮固定細(xì)胞約5到10分鐘。注意：丙酮是易揮發(fā)、可燃性物質(zhì)，使用時請遠(yuǎn)離明火。④從丙酮中取出載玻片并風(fēng)干。⑤在固定并風(fēng)干的細(xì)胞上滴加一滴DFA染色試劑（如圖1），使其完全覆蓋細(xì)胞（注意：2孔或8孔板上有一孔是陰性對照孔，請勿滴加DFA染色試劑）。⑥在呼吸道病毒抗原對照板的每孔內(nèi)也要滴加DFA染色試劑。抗原對照板包含了被病毒感染的細(xì)胞和未感染的細(xì)胞，只能一次性使用。⑦在陰性對照孔內(nèi)滴加正常鼠丙種球蛋白試劑，使其完全覆蓋細(xì)胞。⑧將載玻片放于35oC到37oC的恒溫箱內(nèi)孵育15到30分鐘，為保持其濕潤最好放置于帶蓋的盒子內(nèi)。⑨用事先稀釋好的洗液漂洗染色細(xì)胞。為了更有效地洗滌，請將玻片在洗液中反復(fù)浸蘸4次左右。⑩使用新的1X洗液再洗一次。?用去離子水再洗一遍。圖1、在玻璃板上滴加D3UltraDFA染色試劑3、觀察實驗結(jié)果滴加2到3滴固定液，并加蓋蓋玻片（20X50mm），要注意避免產(chǎn)生氣泡。在200倍放大熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。2.5D3UltraDFA試劑實驗結(jié)果判讀帶FITC標(biāo)記的抗體在熒光顯微鏡下會呈現(xiàn)明亮的綠色，如果細(xì)胞表面存在病毒抗原，染色后就會顯綠色。在熒光顯微鏡下，感染不同病毒的細(xì)胞會呈現(xiàn)獨有的特征（如圖2）。圖2、顯微鏡下觀察染色細(xì)胞（注：根據(jù)不同熒光顯微鏡，背景色不一定為紅色）3．D3UltraDFA試劑競爭優(yōu)勢3.1檢驗的特異性和靈敏度檢驗的特異性:用D3UltraDFA呼吸道病毒篩查和鑒定試劑對多種細(xì)胞和微生物進行交叉反應(yīng)測試。對64種病毒、18種細(xì)胞、19種細(xì)菌均沒有交叉反應(yīng)。檢驗的靈敏度：熒光標(biāo)記的單克隆抗體平均能檢測出病毒的最低濃度約為1.0PFU。3.2市場競爭主要競爭對手為西班牙Vircell公司的9項呼吸道產(chǎn)品。D3UltraDFA試劑與其主要有兩點不同：1.檢測項目不同；2.檢測原理不同1、Vircell產(chǎn)品檢測項目除了以上7種病毒外，還包含肺炎衣原體、支原體等原核生物檢測項目。但是，90%的感冒是由病毒引起的。如果是細(xì)菌、衣原體、支原體等感染，一般白細(xì)胞和C-反應(yīng)蛋白（CRP）都會顯著升高，而病毒感染，這兩項指標(biāo)一般不會升高。我們建議醫(yī)生可以先做血常規(guī)或者CRP檢測，這樣就能區(qū)分是病毒還是細(xì)菌感染，而這兩項測試不僅快速（一般20-30分鐘），而且價格相對便宜。2、D3UltraDFA試劑的檢測原理是用熒光（FITC）標(biāo)記的單克隆抗體檢測病毒抗原，屬于直接熒光免疫法。Vircell產(chǎn)品的檢測原理是用抗原檢測抗體（IgM），使用的方法是間接免疫熒光法。雖然檢測IgM能區(qū)分出是既往感染還是急性感染，但是抗體產(chǎn)生的個體差異較大，特別是1歲以下的嬰幼兒和有免疫缺陷的人群，其抗體往往產(chǎn)生較慢。短時間內(nèi)，在體內(nèi)抗體不足的情況下，可能會出現(xiàn)假陰性，從而錯過了治療的最佳時期。甲型流感病毒其表面抗原變異較快，而人體往往不能及時產(chǎn)生針對新毒株的抗體，這時也會造成假陰性。間接免疫熒光法會增加非特異性反應(yīng)的幾率。表2、Vircell與D3UltraDFA試劑對比VircellD3UltraDFA檢測項目9項呼吸道病原體，其中包含在我國發(fā)病率很低的Q熱立克次氏體只檢測呼吸道病毒，降低患者的看病成本，患者更易接受檢測原理需要體內(nèi)產(chǎn)生抗體后才能檢測出病原體，如果抗體產(chǎn)生較慢或者無抗體產(chǎn)生會有假陰性只要有病原體存在即可檢測，可在發(fā)病早期進行快速診斷臨床意義*作為回顧性診斷，對病例的早期診斷意義不大可用于疾病早期診斷，對患者的治療有重大意義檢測靈敏度不能很好地檢測變異的病毒將多種抗體進行組合，能更好地應(yīng)對變異的病毒，在多項檢測項目中靈敏度達(dá)到100%檢測方法間接免疫熒光法，二抗的使用會增加非特異性反應(yīng)直接免疫熒光法，特異性提高實驗步驟二抗的使用讓實驗步驟變得較為繁瑣一步染色，不易交叉污染*備注：引用自《流行性感冒診斷與治療指南（2011年版）》附錄1七種病毒檢測的臨床意義流感病毒侵入呼吸道，經(jīng)1-2天的潛伏期，感染者即可出現(xiàn)流感癥狀。病毒在上皮細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，很少入血，但可釋放內(nèi)毒素樣物質(zhì)入血，引起全身中毒癥狀：發(fā)熱、頭痛、全身酸痛、疲乏無力、白細(xì)胞數(shù)下降等。幼兒或年老體弱病人感染流感病毒易繼發(fā)細(xì)菌感染，如合并肺炎等，病死率高。嬰幼兒特別是2-6個月的嬰兒對RSV特別敏感，常引起較為嚴(yán)重的呼吸道疾病，如細(xì)支氣管炎、肺炎等，患兒常出現(xiàn)呼吸暫停，氣管或細(xì)支氣管壞死物與粘液、纖維蛋白等結(jié)集在一起，極易阻塞患兒的呼吸道，嚴(yán)重者造成死亡。在我國RSV還是引發(fā)流行性喘憋性肺炎的主要病原，可引起嬰幼兒尤其是新生兒較高的死率。腺病毒主要引起呼吸道感染，癥狀有急性發(fā)燒、咽炎、扁桃體炎等。腺病毒肺炎約占兒童期肺炎的10%，多由腺病毒3、7型引起；嬰幼兒腺病毒肺炎的病死率為8%-10%。除呼吸道疾病外，腺病毒亦可引起其他疾病，如流行性角膜炎、出血性結(jié)膜炎、急性濾泡性結(jié)膜炎等。腺病毒與嬰幼兒胃腸道疾病也有可能相關(guān)，包括闌尾炎、急性胃腸炎，有時可引起腦炎和腦膜炎、出血性膀胱炎等。副流感病毒是引起小兒急性呼吸道感染的常見病因，僅次于RSV。副流感1、2型是哮喘的主要病因，以2-4歲兒童中最為嚴(yán)重。副流感3型，亦可引起哮喘，但主要易引起嬰幼兒支氣管炎、肺炎，并以1歲以內(nèi)的嬰兒較為嚴(yán)重。病毒及其對應(yīng)抗病毒藥病毒種類抗病毒藥物流感病毒金剛烷乙胺、瑞樂沙、奧司他韋（達(dá)菲）呼吸道合胞病毒利巴韋林噴霧劑副流感病毒病情嚴(yán)重者可使用利巴韋林腺病毒沒有專門的抗病毒藥物，主要采取支持療法

附錄2實驗室所需設(shè)備清單（試劑盒中不含）此列表中的器材和試劑是實驗所必需的，但是未包含在試劑盒中，需要單獨購買。器材和試劑規(guī)格1鼻咽拭子建議使用DHI配套鼻咽拭子2載玻片約70mmX20mm3蓋玻片約50mmX20mm4生物安全柜2級5恒溫培養(yǎng)箱35oC-37oC6離心機管式7熒光顯微鏡可以看FITC（490/520nm），總200倍光學(xué)變焦8燒杯多種，用于洗玻片9量筒1L（配置洗液）10帶蓋瓶1L（儲存稀釋洗液）11加樣槍和槍頭多種12丙酮純度100%13普通PBS溶液0.01M(Na2HPO4,KH2PO4)，pH7.414去離子水15乳膠手套16鑷子

附錄3進口熒光顯微鏡參數(shù)生產(chǎn)廠商DigitalBio產(chǎn)地韓國電源AC100-240V，50-60HzCPUAMD