糖尿病與蛋白質(zhì)硝基化

糖尿病與蛋白質(zhì)硝基化

氨基酸硝化是指含有蛋白質(zhì)分子的酪氨酸殘基的硝基含有3-硝基磺酸。3-硝基酪氨酸的形成影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。近年來,2型糖尿病的發(fā)病率在發(fā)達(dá)國家以及發(fā)展中國家都呈上升趨勢。糖尿病及其并發(fā)癥已成為除腫瘤和心腦血管病之外,對國人健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅的疾病。目前的研究表明,蛋白質(zhì)硝基化與糖尿病及其各種并發(fā)癥有密切關(guān)系,了解蛋白質(zhì)硝基化在糖尿病進(jìn)程中的作用,有助于找到治療糖尿病及其并發(fā)癥的途徑。1關(guān)于蛋白質(zhì)硝基化的機(jī)制酪氨酸硝基化作為一種蛋白質(zhì)翻譯后的修飾,常常在氧化應(yīng)激下伴隨活性氧和活性氮的增加而產(chǎn)生。1.1抗氧化防御系統(tǒng)氧對于高能量需求的復(fù)雜有機(jī)體來說是必不可少的,但同時(shí)也是一種有毒物質(zhì),因?yàn)樗纬梢恍┎煌耆闹虚g還原產(chǎn)物:O-·2、H2O2、OH·,這些產(chǎn)物統(tǒng)稱為活性氧(ROS)。人體細(xì)胞有許多酶和非酶系統(tǒng)來阻止或限制ROS的破壞作用,這一防御系統(tǒng)包括:超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶以及小分子的維生素C、E、β-胡蘿卜素。氧化應(yīng)激條件下,由于活性氧的過度生成使細(xì)胞的抗氧化防御系統(tǒng)不能完全消除有毒自由基或失去其防御功能,導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡。NO是一種氣體自由基,近年來大量資料表明炎癥條件下誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的過量表達(dá)會(huì)使NO水平升高,產(chǎn)生細(xì)胞毒性,造成病理損傷。體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)產(chǎn)生大量的NO和ROS,NO被氧化成ONOOˉ,ONOOˉ作為強(qiáng)氧化劑和硝基化劑與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等大分子反應(yīng)。1.23硝化胰島素檢測Turko等提出3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine,3-NT)的生成途徑包括ONOOˉ依賴途徑和過氧化物酶、過氧化氫酶依賴途徑等非ONOOˉ依賴途徑。各途徑均使蛋白質(zhì)酪氨酸殘基或游離酪氨酸發(fā)生硝基化反應(yīng),形成最終產(chǎn)物3-NT。蛋白質(zhì)硝基化后能誘導(dǎo)酶活性的喪失、細(xì)胞的死亡和凋亡。池泉等研究發(fā)現(xiàn),分離出的單硝基化胰島素其受體結(jié)合能力為正常胰島素的69%,降血糖活性有一定程度的降低。硝化胰島素的二級(jí)結(jié)構(gòu)也發(fā)生了變化,α螺旋的含量明顯降低。但是,對蛋白質(zhì)硝基化的研究,體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)情況不一致,需要進(jìn)一步證實(shí)在體內(nèi)是硝化而不是它氧化性修飾改變了蛋白質(zhì)的功能,以及硝化到什么程度才能顯著改變蛋白質(zhì)的功能。2流行趨勢分析隨著社會(huì)的工業(yè)化進(jìn)程加快和人民生活水平不斷提高,糖尿病呈流行趨勢,且呈上升勢態(tài)。目前據(jù)估計(jì),全球約有1.5億2型糖尿病患者。預(yù)計(jì)到2025年,全球2型糖尿病患者將增至3億。在亞洲,以印度和中國糖尿病患者人數(shù)增幅和絕對數(shù)最大。2.1糖尿病患者的糖代謝和血糖國外已有研究表明,糖尿病患者組織中蛋白質(zhì)硝基化程度增高。Turko等于2001年在糖尿病小鼠心肌中發(fā)現(xiàn)線粒體蛋白的琥珀酰輔酶A:3-酮酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶(SCOT)發(fā)生了酪氨酸的硝基化。這是首次對糖尿病患者體內(nèi)的NT進(jìn)行特定蛋白的定位,為后續(xù)研究NT與糖尿病及其并發(fā)癥的關(guān)系提供了指導(dǎo)。Antonio等發(fā)現(xiàn)糖尿病患者的內(nèi)皮細(xì)胞和糖尿病小鼠的視網(wǎng)膜細(xì)胞在血糖正常一周后其高血糖應(yīng)激的標(biāo)志物3-NT仍保持誘導(dǎo)表達(dá)。糖尿病患者的心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞凋亡與細(xì)胞外NT水平相關(guān),凋亡的心肌細(xì)胞中存在NT富集現(xiàn)象。Ishii等在糖尿病小鼠中發(fā)現(xiàn),糖尿病早期腎皮質(zhì)中O-·2和NO生成增加,并且用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)證實(shí)了腎皮質(zhì)中3-NT的增加。這些結(jié)果無疑對探索糖尿病的發(fā)病機(jī)制有著積極的意義,但并不是所有的研究都支持上述結(jié)論。例如,Ahmed等研究發(fā)現(xiàn),1型糖尿病患者血紅蛋白中的3-NT殘基含量降低。Wang等采用HPLC法測得墨西哥裔美國人糖尿病患者血漿NT水平與正常對照相比無顯著性差異。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不同可能由各檢測方法和檢測水平不同所致。2.2氧化應(yīng)激作用Antonio等證明在2型糖尿病人群中,血漿NT水平與血糖濃度呈正相關(guān),餐后高血糖現(xiàn)象也與酪氨酸硝基化現(xiàn)象伴隨出現(xiàn)。有研究表明,用高濃度血糖灌注離體心臟,將明顯地升高冠狀動(dòng)脈灌注壓并伴隨著3-NT的生成。這證明了氧化應(yīng)激介導(dǎo)了高血糖引起的血管損傷,以及3-NT為糖尿病患者氧化損傷的標(biāo)志物。Ccsentino等發(fā)現(xiàn)長時(shí)間暴露于高血糖的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞,NO合酶基因表達(dá)增加,相應(yīng)蛋白質(zhì)和NO的釋放也增加,且與活性氧產(chǎn)物的增加相關(guān)聯(lián),O-·2產(chǎn)物在高血糖時(shí)比正常時(shí)增加了3倍。Antonio等用普蘭林肽治療2型糖尿病患者,在降低餐后血糖的同時(shí)也明顯降低了3-NT的含量,減少了餐后高血糖的氧化應(yīng)激。但也有研究認(rèn)為3-NT水平與餐后血糖濃度的正相關(guān)關(guān)系只有在減少攝入某些抗氧化維生素后才明顯。2.3動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué)及免疫藥物的作用糖尿病對身體的危害主要來自高血糖導(dǎo)致的多種并發(fā)癥,而心血管系統(tǒng)是糖尿病并發(fā)癥的主要受累系統(tǒng)之一。糖尿病患者的動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病率比非糖尿病患者高2~4倍,而且發(fā)病年齡提前,病情也較重。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,糖尿病高血壓小鼠主動(dòng)脈中3-NT蛋白的表達(dá)明顯高于正常血壓糖尿病小鼠。Turko等對糖尿病小鼠心肌細(xì)胞線粒體功能的研究發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)的硝基化影響蛋白質(zhì)的功能,而抗硝基化的防御系統(tǒng)可以保護(hù)特異性功能蛋白。Turko等在線粒體中找到發(fā)生硝基化的蛋白質(zhì)后,進(jìn)一步采用四氧嘧啶敏感和四氧嘧啶抗性的小鼠進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠心肌線粒體SCOT的硝基化是一個(gè)普遍現(xiàn)象,其結(jié)果可能導(dǎo)致線粒體功能障礙。在2型糖尿病患者的血液中,硝基化載脂蛋白A-I(apolipoproteinA-I,ApoA-I)含量明顯增高,比正常同齡對照高50%,而ApoA-I的氧化損傷與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系密切。一系列的研究表明:人動(dòng)脈粥樣硬化組織中含有酪氨酸硝基化的蛋白質(zhì),且這種硝基酪氨酸與一氧化氮合酶(NOS)表達(dá)密切相關(guān),動(dòng)脈粥樣硬化各階段富含巨噬細(xì)胞的受損部位都能檢測到NOS和硝基化蛋白質(zhì)。另有研究認(rèn)為自身免疫性心肌炎總是伴隨著NOS的表達(dá)和酪氨酸硝基化蛋白質(zhì)在巨噬細(xì)胞以及心肌內(nèi)皮細(xì)胞中的累積;原發(fā)性擴(kuò)張性心肌病(dilatedcardiomyopathy,DCM)患者心臟中NT水平是同齡對照正常人的2倍,免疫沉淀證實(shí)硝基化主要發(fā)生在肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶2a(SERCA2a),而SERCA2a硝基化可導(dǎo)致Ca2+-ATP酶的失活,從而引起心力衰竭。蛋白質(zhì)硝基化普遍存在于心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展階段,但其在心血管疾病中的具體作用方式和作用機(jī)制至今尚不完全明了。例如高血壓與內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、O-·2增加和NO產(chǎn)生降低有關(guān),但是有關(guān)高血壓和NOS表達(dá)以及內(nèi)皮細(xì)胞損傷之間的分子機(jī)制,至今還沒有完整的解釋。2.4苯基化酪氨酸檢測在美國,糖尿病是引起終末期腎病的主要原因,并占其總數(shù)的1/3。Ishii等利用單克隆抗硝基化酪氨酸的抗體免疫印記技術(shù),發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠腎皮質(zhì)中70kD蛋白質(zhì)的硝基化酪氨酸含量是正常對照組的3倍。這表明氧化應(yīng)激在糖尿病病程早期加速了腎皮質(zhì)過氧化陰離子的產(chǎn)生,也增加了NO的終產(chǎn)物。2.53氧化應(yīng)激引起糖尿病患者視網(wǎng)膜免疫組化糖尿病是引起30~65歲人群失明的主要原因,糖尿病患者失明的發(fā)生率是非糖尿病人群的20倍以上,視網(wǎng)膜病變在15歲以上的糖尿病患者中最為常見。糖尿病視網(wǎng)膜病涉及炎性過程,其中的NO、NOS是重要的炎性介質(zhì),ROS的慢性過量生成會(huì)導(dǎo)致糖尿病患者視網(wǎng)膜細(xì)胞線粒體功能紊亂,并且其產(chǎn)物如3-NT在糖尿病性視網(wǎng)膜中也增加。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí),氧化應(yīng)激及其產(chǎn)物3-NT不僅在糖尿病視網(wǎng)膜病的進(jìn)展過程中起負(fù)作用,而且在控制血糖之后,也抵抗視網(wǎng)膜病的逆轉(zhuǎn),導(dǎo)致了代謝記憶現(xiàn)象。但是3-NT在視網(wǎng)膜上的作用靶點(diǎn)以及硝基化在糖尿病視網(wǎng)膜病中的作用機(jī)制尚不清楚。抗氧化治療在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對視網(wǎng)膜病的進(jìn)展有阻礙作用,但在臨床實(shí)驗(yàn)中抗氧化治療對視網(wǎng)膜病的效果還很模糊。2.63對糖脂質(zhì)過氧化的調(diào)整糖尿病神經(jīng)病變臨床表現(xiàn)多樣化,其致病因素也是多樣的。高血糖為一突出的因素,許多證據(jù)證明氧化應(yīng)激參與糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生,如末梢對稱性多發(fā)性神經(jīng)病(distalsymmetricpolyneuropathy)。在糖尿病動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中,動(dòng)物的脊髓及其背側(cè)根部的神經(jīng)元對高血糖介導(dǎo)的氧化應(yīng)激更敏感,更易發(fā)生細(xì)胞凋亡。Cameron等在2001年指出:高血糖導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷和引起氧化應(yīng)激,進(jìn)而使NO生成增加,而NO使血管舒張,導(dǎo)致神經(jīng)局部缺血,引起軸突損傷甚至神經(jīng)細(xì)胞死亡。3降血糖治療糖尿病并發(fā)癥的作用機(jī)制抗蛋白質(zhì)硝基化治療的途徑包括減少活性氮(RNS)和活性氧的生成。根據(jù)以往的研究成果,抗氧化劑特別是食物中天然的具有抗氧化作用的營養(yǎng)素如維生素E、維生素C、微量元素硒等是活性氮的有效清除劑,即也是有效的抗硝基化劑。此外,分解ONOO-的催化劑、抗氧化酶催化劑等也能減少活性物質(zhì)的生成。不少研究證實(shí)食物中存在的非營養(yǎng)素成份——生物類黃酮也具有較強(qiáng)的抗氧化、抗硝化作用。然而,目前還沒有實(shí)驗(yàn)證實(shí)食入抗氧化食物是直接降低體內(nèi)硝基化水平而不是通過影響氧化應(yīng)激水平,進(jìn)而改變疾病的進(jìn)展。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,他汀類的藥物——西立伐他汀可以改善心肌梗塞后小鼠的左室重構(gòu),并且可以降低蛋白質(zhì)硝基化水平。Szabo等研究發(fā)現(xiàn)FP15,一種有力的過氧亞硝酸鹽分解催化劑,可以防止糖尿病小鼠發(fā)生血管和心肌的功能紊亂,并且可以減少糖尿病胰腺胰島細(xì)胞中的3-NT量。Antonio等發(fā)現(xiàn)1型血管緊張素Ⅱ(AT-1)受體拮抗劑依貝沙坦可以降低糖尿病患者血漿NT水平,并且能在急性高血糖狀態(tài)下有效地對抗3-NT的形成。Antonio等對36名1型糖尿病患者和12名正常對照進(jìn)行降血糖和維生素C、替米沙坦治療后發(fā)現(xiàn),單純用胰島素降低高血糖或用維生素C治療都不能改善內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂或氧化應(yīng)激狀態(tài),必須二者聯(lián)合應(yīng)用;同時(shí)發(fā)現(xiàn)替米沙坦也同維生素C一樣,是一種抗氧化劑。然而,用抗氧化物質(zhì)灌注系統(tǒng)或使抗氧化物酶過度表達(dá)可能和過度暴露于RNS/ROS中一樣危險(xiǎn)。因此,主要的問題是鑒別出RNS/ROS有利和有害作用之間的濃度界限。另一個(gè)問題是,改變硝基化酪氨酸能否有利于疾病的進(jìn)展,這需要鑒定出發(fā)生硝基化的特定蛋白質(zhì),并且證明這種蛋白質(zhì)的功能改變與并發(fā)癥的進(jìn)展相關(guān)。也有學(xué)者認(rèn)為抗氧化劑治療心血管疾病的作用有限,因?yàn)樗荒苡行У厍宄呀?jīng)存在的氧化損傷產(chǎn)物。比如:維生素E在細(xì)胞膜水平可以阻止活性自由基的增加,但是