基因（基因工程課件）

基因概述CONTENTS目錄01基因?qū)W說的創(chuàng)立02基因與DNA分子的關(guān)系03基因的概念04基因的特點(diǎn)05基因的分類06基因的結(jié)構(gòu)基因?qū)W說的創(chuàng)立遺傳因子（hereditaryfactor）概念孟德爾提出1857年到1864年，豌豆雜交試驗(yàn)。雙因子雜交試驗(yàn)子一代種子全是黃色圓形自交黃色圓形：黃色皺形：綠色圓形：綠色皺形9：3：3：1黃圓種子綠皺種子子一代種子全是圓形自交圓皺比3：1圓形種子皺形種子推想：每一性狀都由遺傳因子控制，這些因子從親代到子代，代代相傳；體細(xì)胞中：遺傳因子成對存在，一個(gè)來自父本，一個(gè)來自母本；配子中：成對的遺傳因子彼此分開，成單存在；雜交子一代體細(xì)胞中：成對的遺傳因子各自獨(dú)立存在。在形成配子時(shí)，彼此分離；令人遺憾的是，孟德爾的這些科學(xué)發(fā)現(xiàn)和見解湮沒了35年。1900年，荷蘭H.DeVries、德國C.Correns和奧地利E.Tschermak等植物學(xué)家，各自獨(dú)立地做了與孟德爾相似的實(shí)驗(yàn)，得出了與孟德爾相似的結(jié)論。1909年，丹麥生物學(xué)家W.Johannsen根據(jù)希臘文“給予生命”之義，創(chuàng)造了（gene)一詞，并用這個(gè)術(shù)語來代替孟德爾的“遺傳因子”。美國著名的遺傳學(xué)家摩爾根（T.H.Morgan）對基因?qū)W說的建立做出了卓越的貢獻(xiàn)。1910年，摩爾根和他的助手，從紅眼的果蠅群體中發(fā)現(xiàn)了一只白眼的雄果蠅。正常果蠅都是紅眼（）野生型），白眼果蠅為突變型。1915年子一代全部紅眼果蠅自交有紅眼、有白眼所有白眼果蠅都是雄性白眼雄果蠅解釋：果蠅有4對染色體雌果蠅：1對很小呈粒狀，2對呈V形，1對呈棒狀的特征為XX染色體；雄果蠅：前3對同雌果蠅的完全一樣，但沒有1對棒狀的XX染色體，它是由1個(gè)棒狀的X染色體和一個(gè)J形的Y染色體取代，這一對叫做XY染色體。紅眼雌果蠅摩爾根推測：白眼：隱性性狀的基因（W）是位于X染色體上，而在Y染色體上沒有其等位基因。實(shí)驗(yàn)：子一代紅眼雌果蠅（Ww），跟親本白眼雄果蠅（wY）回交，后代1/4是紅眼雌果蠅，1/4是白眼雄果蠅。證實(shí)：白眼隱性突變基因（w）確實(shí)位于X染色體上，這種現(xiàn)象為遺傳性狀的連鎖定律?；?qū)W說得到了普遍地承認(rèn)但是，基因的結(jié)構(gòu)特征是怎樣的？基因怎樣進(jìn)行復(fù)制的？基因與DNA分子的關(guān)系實(shí)驗(yàn)證明基因的化學(xué)本質(zhì)是DNA分子美國著名的微生物學(xué)家O.T.Avery和他的合作者C.M.Mleod及M.McCarty將S型（光滑、有毒）肺炎鏈球菌的DNA加到R型（粗糙、無毒）肺炎鏈球菌的培養(yǎng)物中，使R型轉(zhuǎn)變成S型，表現(xiàn)出具有毒力的莢膜的特性。說明，使細(xì)菌性狀發(fā)生變化的是DNA而不是蛋白質(zhì)或RNA分子。1952年，肯定了Avery的結(jié)論。美國冷泉港卡內(nèi)基遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室A.D.Hershey和他的學(xué)生M.Chase。用放射性同位素32P和35S,分別標(biāo)記T2噬菌體DNA和外殼蛋白質(zhì)。雙標(biāo)記的噬菌體感染大腸桿菌。結(jié)果：只有32P標(biāo)記的DNA注入到寄主細(xì)胞內(nèi)，并且重新繁殖出子代噬菌體。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明：在噬菌體中的遺傳物質(zhì)也是DNA分子，而不是蛋白質(zhì)。證明了DNA是遺傳物質(zhì)和基因的載體研究表明：在生物界并非所有的基因都是由DNA構(gòu)成的。某些動物病毒和植物病毒以及某些噬菌體。遺傳物質(zhì)是RNA而不是DNA?；虻母拍羁刂菩誀畹幕具z傳單位。排列在染色體上，攜帶特定遺傳信息；具有一定結(jié)構(gòu)；自我復(fù)制與信息傳遞的一段DNA或RNA序列。基因的概念控制性狀的基本遺傳單位。排列在染色體上，攜帶特定遺傳信息；具有一定結(jié)構(gòu)；自我復(fù)制與信息傳遞的一段DNA或RNA序列?；虻母拍羁刂菩誀畹幕具z傳單位。排列在染色體上，攜帶特定遺傳信息；具有一定結(jié)構(gòu)；自我復(fù)制與信息傳遞的一段DNA或RNA序列。基因的特點(diǎn)基因決定性狀自我復(fù)制：半保留復(fù)制基因有相對的穩(wěn)定性基因會發(fā)生突變基因的分類按照重要程度分類看家基因：維持細(xì)胞基本功能的基因；必需基因：突變致死基因；按物種分類原核基因真核基因病毒基因按基因拷貝數(shù)分類單拷貝基因多拷貝基因按照功能分：結(jié)構(gòu)基因：能夠翻譯的基因調(diào)控基因：調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)節(jié)基因、操縱基因、啟動基因只轉(zhuǎn)錄不翻譯的基因：rRNA基因、tTNA基因；基因的結(jié)構(gòu)真核生物基因結(jié)構(gòu)5’-UTR結(jié)構(gòu)基因3’-UTR增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)啟動子外顯子終止子內(nèi)含子Poly-A結(jié)構(gòu)基因：不連續(xù)，內(nèi)含子與外顯子交替排列。并非所有結(jié)構(gòu)基因都包含內(nèi)含子。外顯子（exon)：結(jié)構(gòu)基因中的編碼序列，在成熟mRNA中保留的片段。內(nèi)含子（intron)：結(jié)構(gòu)基因中的非編碼序列，在mRNA成熟過程中被切除的部分。啟動子（promoter):位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的一段DNA序列,是RNA聚合酶識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)。增強(qiáng)子：啟動子上游或下游的一段序列，增強(qiáng)啟動子轉(zhuǎn)錄，提高轉(zhuǎn)錄效率。終止子：阻礙RNA聚合酶移動，終止RNA轉(zhuǎn)錄的DNA序列。UTR:非翻譯區(qū)?；虻慕Y(jié)構(gòu)原核生物基因結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)基因半乳糖苷酶基因調(diào)節(jié)基因啟動子滲透酶基因轉(zhuǎn)乙酰酶基因結(jié)構(gòu)基因啟動子阻遏蛋白結(jié)合位點(diǎn)原核生物基因的功能單位：操縱子，含有一個(gè)啟動子核多個(gè)結(jié)構(gòu)基因。大腸桿菌乳糖操縱子由3個(gè)結(jié)構(gòu)基因和一個(gè)操縱基因組成：調(diào)節(jié)基因lacI的表達(dá)產(chǎn)物（阻遏物（repressor)），與操縱基因結(jié)合，阻遏結(jié)構(gòu)基因lacZ、lacY和lacA表達(dá)。β-半乳糖苷酶（β-galactosidase)、透性酶（permease)和乙酰基轉(zhuǎn)移酶（acetylase)的合成也就停止下來。當(dāng)細(xì)胞中代謝產(chǎn)物乳糖（lactose)累積增多，與阻遏物結(jié)合，使阻遏物與操縱基因脫離，結(jié)構(gòu)基因恢復(fù)轉(zhuǎn)錄，合成出參與乳糖代謝的3種酶蛋白。乳糖起到一種誘導(dǎo)物（inducer)的作用。基因的結(jié)構(gòu)病毒基因功能相關(guān)的基因排列在一起。基因結(jié)構(gòu)不規(guī)則。有重疊基因。兩個(gè)或兩個(gè)以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成為兩個(gè)或兩個(gè)以上基因的組成部分。PCR擴(kuò)增技術(shù)CONTENTS目錄01PCR擴(kuò)增技術(shù)發(fā)明02PCR擴(kuò)增技術(shù)原理03PCR反應(yīng)五要素04DNA聚合酶05PCR的類型PCR擴(kuò)增技術(shù)發(fā)明PCR（PolymeraseChainReaction）法，又稱為聚合酶鏈反應(yīng)，是一種高效快速的體外DNA聚合程序。由1985年穆里斯（K.Mullis）發(fā)明，因此獲得了1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

PCR法克隆目的基因前提：已知待擴(kuò)增目的基因兩側(cè)序列，根據(jù)該序列合成反應(yīng)必需的雙引物。PCR擴(kuò)增技術(shù)原理包括三個(gè)步驟：

=>DNA模板變性(95℃)=>與DNA引物退火(45℃-55℃)=>引物延伸(72℃)30-35個(gè)循環(huán)變性退火延伸延伸PCR擴(kuò)增技術(shù)的基本原理PCR反應(yīng)五要素

模板：按照模板的序列合成新鏈。引物：結(jié)合在模板的3’端，在引文的3’端開始合成新鏈。dNTP：PCR合成原料。緩沖溶液：提供反應(yīng)的液體環(huán)境。DNA聚合酶：合成新鏈。DNA聚合酶DNA聚合酶的種類依賴于DNA的DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ(全酶)DNA聚合酶Ⅰ大片段(klenow片段)耐熱DNA聚合酶(Taq

酶)依賴于RNA的DNA聚合酶:反轉(zhuǎn)錄酶不依賴于DNA的DNA聚合酶:末端轉(zhuǎn)移酶E.coliDNA聚合酶I（pol

I）

1.E.coli的DNA聚合酶系統(tǒng)PolI

polII

polIII

2.E.colipolI

在蛋白酶作用下，該酶分裂成兩個(gè)大小不同的片段小片段具5’→3’外切酶活性大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦稱為Klenow片段,pol

IK)DNaseI1.特點(diǎn)：具內(nèi)切酶活性，無序列特異型；作用于ds-DNA，產(chǎn)生5’-P低聚核苷酸;當(dāng)酶濃度很低時(shí)，ds-DNA分子上形成切口。

2.用途

1)制備DNA探針

2)制備RNA樣品時(shí),除去DNA分子

3)基因突變時(shí)產(chǎn)生切口大腸桿菌DNA聚合酶I基本用途5’→3’外切5’→3’聚合制備32P標(biāo)記的探針DNA聚合酶I5’G-C-A-T-C-A-T-G-G-C-T-A-C-T-T-G-G-A-C3’3’C-G-T-A-G-T-A-C-C-G-A-T-G-A-A-C-C-T-G5’5’G-C-A-T-CA-T-G-G-C-TA-C-T-T-G-G-A-C3’3’C-G-T-A-G-T-A-C-C-G-A-T-G-A-A-C-C-T-G5’DNA聚合酶I4種dNTPppp32dA5’G-C-A-T-C-A-T-G-G-C-T-A-C-T-T-G-G-A-C3’3’C-G-T-A-G-T-A-C-C-G-A-T-G-A-A-C-C-T-G5’雙鏈DNA（基因）分子用一條單鏈作為模板信使RNA分子，以其為模板互補(bǔ)的單鏈DNA，以其為模板組成一個(gè)雙鏈cDNA分子cDNA短，比基因少了內(nèi)含子依賴于RNA的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）轉(zhuǎn)錄并成熟合成cDNA依賴于RNA的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）雙向外切DNA/RNA雜合鏈中的RNA鏈RNADNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶TaqDNA聚合酶1）來自水生棲熱菌Thermusaquaticus；2）良好的耐熱性；3）Mg2+依賴性；4）無校正功能。特點(diǎn)：最適反應(yīng)溫度75℃對95℃高溫具良好穩(wěn)定性不存在3’→5’外切酶活性用途：PCRPCR的類型多重PCR定量PCR差異顯示PCR錨定PCRRT-PCR-----多重PCR: