核酸-核酸的性質(zhì)（生物化學(xué)課件）

核酸的變性復(fù)性2核酸的變性和復(fù)性1變性(denaturation):

加熱或某些試劑處理時，DNA中堿基間氫鍵斷裂和相鄰堿基間的堆集力受到破壞,有規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)逐漸變?yōu)榻茻o規(guī)則線團，也稱熔解。

降解:核酸骨架上的3’，5’-磷酸二酯鍵的斷裂為降解。

3◆變性種類：

熱變性、

酸變性、

堿變性(pH=11.3時氫鍵均斷裂)、

變性劑(尿素,甲酰胺等)、

鹽濃度低于0.01Mol/L時靜電斥力使可配對的堿基無法靠近。4◆變性后表現(xiàn):

DNA變?yōu)椤熬€團”故粘度下降,生物活性降低，沉降速度加快。RNA的粘度比DNA粘度小。

DNA變性時其一級結(jié)構(gòu)不改變,空間結(jié)構(gòu)(三維結(jié)構(gòu)構(gòu)象)，雙螺旋結(jié)構(gòu)破壞

增色效應(yīng):核酸變性后，增加了A260的光吸收。5◆DNA的熔解溫度(Tm):

通常把DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時的溫度,或A260增加到最大增值的一半時的溫度稱DNA的熔點,或熔解溫度.

用Tm表示。DNA的Tm值一般在70-85℃之間。

變性的過程通常是一個躍變的過程,發(fā)生在一個很窄的溫度范圍內(nèi),一般為6-8℃。6Tm

影響Tm大小的因素:▽DNA的均一性。均一性越高,

DNA熔解溫度范圍越窄。

▽不同來源的DNA的Tm值是不同的，DNA分子中的(G+C)含量與Tm值有關(guān)，GC%越高,則Tm值越大。這是由于在DNA分子中，G≡C堿基對特別穩(wěn)定的原因。G-C%=(Tm-69.3)*2.44,Tm=69.3+0.41*GC%▽介質(zhì)的離子強度越低,DNA的Tm越低,熔解溫度的范圍越窄.故DNA制品應(yīng)保存在較高濃度溶液中.常常在1mol/LNaCl溶液。82復(fù)性(renaturation)◆變性DNA兩條單鏈在適當(dāng)條件下,又可使兩條彼此分開的鏈重新締合,成為雙螺旋結(jié)構(gòu)。這一過程稱作復(fù)性,也稱退火(annealing)?！魪?fù)性時DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中堆積的堿基間的電子相互作用減低了對紫外光的吸收，發(fā)生減色效應(yīng)(A260下降)。10◆影響復(fù)性的因素：

熱變性的DNA在緩慢冷卻時可發(fā)生復(fù)性,但迅速冷卻時則難以完全復(fù)性。

DNA片段越大，復(fù)性越慢,

DNA濃度越大，復(fù)性越快?！魪?fù)性的條件:

鹽溶液濃度：

溫度：

介質(zhì)中要有足夠的鹽濃度以消除磷酸的靜電斥力0.15-0.50mol/LNaCl.

有足夠高的溫度以破壞無規(guī)則的鏈內(nèi)氫鍵,但又不能太高,否則配對堿基間的氫鍵難以形成.12核酸紫外吸收特性及其他特性15一、核酸紫外吸收1.嘌呤堿、嘧啶堿具有共軛雙鍵,使堿基、核苷、核苷酸、核酸在240-290nm有紫外吸收,260nm最大吸收。16◆純樣品時，當(dāng)濃度為50ug/ml,dsDNA的A260=1.00.

1A260相當(dāng)于50ug/mldsDNA,相當(dāng)于33ug/mlssDNA或40ug/mlRNA,相當(dāng)于20ug/ml寡核苷酸.吸光值與濃度關(guān)系：◆

純DNA的A260/A280=1.8,RNAA260/A280=2.0,

不純的樣品不能用這個方法。含雜質(zhì)(如蛋白質(zhì)、酚)時比值明顯下降173.減色效應(yīng)：雙螺旋結(jié)構(gòu)和3

，5

—磷酸二酯鍵都會減弱堿基對紫外光的吸收。

天然DNA、變性DNA的吸光率比核苷酸單體的總吸收率小?！艏儤悠窌r，當(dāng)濃度為50ug/ml，dsDNA的A260=1.00，ssDNAA260=1.37，單核苷酸的等比例混合物的A260=1.60。18核苷酸總吸值值變性DNA天然DNA19二、核酸的沉降特性溶液中的核酸分子在引力場中可以沉降。不同構(gòu)象的核酸，蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)，在超速離心機的強大離心場中，沉降的速率差異很大，所以可以用超速離心法純化核酸或?qū)⒉煌瑯?gòu)象的核酸進行分離，也可測定核酸的沉降系數(shù)與分子量。20三、凝膠電泳（一）瓊脂糖電泳以瓊脂糖為支持物。電泳的遷移率決定于以下因素：1、核酸分子大?。哼w移率與分子量對數(shù)成反比2、膠濃度：遷移率與膠濃度成反比。常用1%膠分離DNA3、DNA的構(gòu)向：一般條件下超螺旋DNA的遷移率最快，線形DNA其次，開環(huán)形最慢。但在膠中假如啡啶溴紅時，上述分布次序回發(fā)生改變4、電流：一般不大于5V/cm，在適當(dāng)?shù)碾妷合?，遷移率與電流大小成正比5、堿基組成：有一定影響，但不大6、溫度：4~30℃都可瓊脂糖凝膠電泳常用于分析DNA。由于瓊脂糖制品中往往帶有核糖核酸酶雜質(zhì)，所以用于分析RNA時，必須加入蛋白質(zhì)變性劑，如甲醛。電泳完畢后，將膠在熒光染料啡啶溴紅的水溶液中染色。DNA與啡啶溴紅結(jié)合后，經(jīng)紫外光照射，可發(fā)出紅-橙色可見光。0.1μg的DNA即可用此法檢出，十分靈敏。21（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳以聚丙烯酰胺作為支持物。由于這種凝膠的