紹興黃酒麥曲中可溶性總蛋白的分離

紹興黃酒麥曲中可溶性總蛋白的分離

小麥在黃酒的生產(chǎn)過程中起著非常重要的作用。被稱為“酒的骨架”。這不是黃酒的“一般酶劑”。此外，小麥草中積聚了多種微生物代謝產(chǎn)物，給黃酒帶來了獨特的味道。研究表明,麥曲中微生物胞外酶主要是來源于各種霉菌和細菌分泌的各類水解酶系,包括淀粉酶系、蛋白酶系、纖維素酶系、半纖維素酶系、脂肪酶系等等。這些復合酶系共同作用將麥曲中的各種大分子物質(zhì)(淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪等)分解為小分子物質(zhì),以便微生物的生長、繁殖、產(chǎn)酶、產(chǎn)酒。目前國內(nèi)直接針對黃酒麥曲中微生物胞外酶的研究開展得較少,主要是利用色譜技術對麥曲中單一酶類進行純化并開展酶學性質(zhì)研究,如作者所在實驗室就曾開展紹興黃酒麥曲中α-淀粉酶的分離、純化及其酶學性質(zhì)的研究,通過現(xiàn)有的酶學研究方法,無法達到全面獲取麥曲中微生物胞外酶組成,確定其微生物來源的目的。宏蛋白質(zhì)組學(metaproteomics)是最近幾年被提出的新概念,其定義是指對某一特定環(huán)境中微生物群落的所有蛋白質(zhì)進行大規(guī)模的分析和鑒定。宏蛋白質(zhì)組的研究策略與經(jīng)典的蛋白質(zhì)組研究策略相似,主要包括環(huán)境總蛋白的提取純化、蛋白質(zhì)分離以及質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)比對3個步驟。其中蛋白質(zhì)的分離步驟一般采取雙向電泳或液相色譜方法。本研究借助于宏蛋白質(zhì)組學的理論和思想,利用雙向電泳技術對從紹興黃酒成品麥曲中浸提出的所有可溶性蛋白(主要是各種微生物分泌的胞外酶蛋白,原料小麥的可溶性蛋白絕大部分已在固態(tài)發(fā)酵過程中被降解為小分子肽段)進行高分辨率分離,為后續(xù)通過質(zhì)譜分析手段大規(guī)模鑒定麥曲中的微生物胞外酶,并進一步弄清其微生物來源奠定基礎。由于雙向電泳實驗周期長、步驟繁瑣、操作性強,實驗過程中各個環(huán)節(jié)均影響雙向電泳的分離效果,且直接關系到后期蛋白質(zhì)譜分析的準確性和可靠性,對于不同來源的樣品,一般都需要摸索出專用的實驗條件。因此,針對某一具體樣品的雙向電泳實驗方法的建立是高通量分析蛋白質(zhì)混合物的先決條件。本研究的目標就是通過優(yōu)化影響雙向電泳結果的關鍵條件,建立一套高分辨率、高穩(wěn)定性和高重復性的紹興黃酒成品麥曲微生物胞外酶雙向電泳技術體系。1材料和方法1.1材料表面1.1.1小麥的曲線紹興黃酒機制麥曲:由浙江古越龍山紹興酒股份有限公司提供。1.1.2抑制劑及混合片的制備瓊脂糖、溴酚藍、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰銨(IAA)、固相IPG干膠條(非線性,pH值為3～10,7cm)、IPGBuffer(pH值為3～10)、IPG覆蓋液均為GE公司產(chǎn)品;CHAPS、脲為Amersham公司產(chǎn)品;Complete蛋白酶抑制劑混合片為Roche公司產(chǎn)品;丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉(SDS)、Tris堿、過硫酸銨、甘氨酸、考馬斯亮藍G-250、考馬斯亮藍R-250為純化級產(chǎn)品;甲醇、正丁醇、甘油、冰醋酸、磷酸、三氯乙酸(TCA)、丙酮、乙酸鈉、牛血清白蛋白均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。1.1.3材料、設備和分析方法等電聚焦電泳儀EttanIPGphor3:GE公司產(chǎn)品;高電流電泳儀:BIO-RAD公司產(chǎn)品;小型垂直電泳槽:BIO-RAD公司產(chǎn)品;TY-80S/80B脫色搖床:生興生物技術有限公司產(chǎn)品;JD-801凝膠電泳圖像分析系統(tǒng):江蘇省捷達科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品;CR22G型高速冷凍離心機:日本日立公司產(chǎn)品;Pico&Fresco17微量離心機:Thermo公司產(chǎn)品;UV-2100型紫外可見分光光度計:尼龍柯儀器有限公司產(chǎn)品。1.1.4dtildj樣品裂解液:脲4.8g,CHAPS0.4g,IPG緩沖液50μL,加入雙蒸水至總體積為10mL(使用前加入20mmol/LDTT)。平衡液I:脲72.07g、SDS4.0g、1.5mol/LTris-HCl6.7mL(pH8.8)、甘油69mL、1g/dL溴酚藍貯存液400μL,加入雙蒸水至200mL,使用前每10mL加入DTT100mg。平衡液II:脲72.07g、SDS4.0g、1.5mol/LTris-HCl6.7mL(pH8.8)、甘油69mL、1g/dL溴酚藍貯存液400μL,加入雙蒸水至200mL,使用前每10mL加入IAA250mg。1.2方法1.2.1樣品制備1粗酶提取液的制備秤取25g麥曲,加入50mL0.09mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液和一片Complete蛋白酶抑制劑混合片,在4℃條件下浸提過夜。然后依次用4層紗布、濾紙過濾,濾液在10000r/min,4℃條件下離心30min,上清液即為粗酶提取液。Bradford法測定蛋白含量。2檢測蛋白的提取取一定量粗酶提取液,加入4倍體積的預冷丙酮溶液Ⅰ(含20mmol/LDTT,10g/dLTCA),搖勻,-20℃放置1h沉淀蛋白,之后4℃下12000r/min離心30min。棄上清,收集沉淀。加入2mL預冷的丙酮溶液Ⅱ(含20mmol/LDTT),-20℃放置1h,清洗沉淀,4℃12000r/min離心15min。重復清洗一次。棄上清,收集沉淀,然后置于-20℃冰箱中,使丙酮完全揮發(fā)。3麥曲宏蛋白質(zhì)組的檢測將干燥好的蛋白質(zhì)沉淀加入適量的樣品裂解液,室溫下充分溶解,然后12000r/min離心10min,上清液即為麥曲宏蛋白質(zhì)組樣品。Bradford法測定蛋白含量。1.2.2聚丙稀酰胺凝膠的等電聚合按照GE公司《雙向電泳操作手冊》進行水化上樣和等電聚焦。在Immobiline干膠條再泡脹盤中加入適量麥曲宏蛋白質(zhì)組樣品,將IPG干膠條水平放入其中,加入少量IPG覆蓋液,水化過夜。水化過夜后的膠條轉移到EttanIPGphor膠條槽中,設置等電聚焦程序進行等電聚焦。等電聚焦結束后,立即進行平衡。采用兩步平衡法,將IPG膠條先后在平衡液I和平衡液II中平衡15min。平衡后進行第二向SDS電泳,分離膠質(zhì)量濃度為12.5g/dL(10cm×7cm×1mm)。將平衡后的IPG膠條轉移到已聚合的聚丙稀酰胺凝膠膠面頂端,用0.5g/dL的瓊脂糖封閉,排除膠條與膠面之間的氣泡。以恒流方式進行電泳:10mA,10min,然后電流調(diào)至20mA。當溴酚藍指示劑遷移到凝膠底部時,關閉電源,結束電泳。采用考馬斯亮藍染色法對凝膠進行染色。1.2.3二維硬膠電泳分析脫色后的雙向電泳凝膠用捷達JD-801凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)對其進行掃描分析。2結果與討論2.1確定等電聚焦程序等電聚焦時間過長會導致電內(nèi)滲和蛋白移動,從而產(chǎn)生水平拖尾;而聚焦時間過短,會導致蛋白壓縮不夠緊密,形成橫向糊狀拖尾。為研究等電聚焦的關鍵條件對本研究樣品雙向電泳效果的影響,首先進行了等電聚焦條件的摸索。根據(jù)固相IPG干膠條(非線性,pH3～10,7cm)使用說明書建議,設定不同的等電聚焦總伏特小時數(shù)(Vh)進行試驗。研究結果表明,當總伏特小時數(shù)設定值為不低于7500V·h時,樣品的聚焦效果較好,雙向電泳圖譜的分辨率較高。因此,最終確定等電聚焦程序為:①Step,300V×2h;②Gradient,1000V×0.5h;③Gradient,5000V×1.5h;④Step,5000V,2000Vh。2.2電泳圖譜的分析黃酒大罐發(fā)酵過程中發(fā)酵醪液的pH值范圍為3.5～5.0左右,故本實驗分別選取pH值為4.2、4.4、5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液浸提麥曲,制備麥曲的可溶性總蛋白樣品。在上樣量基本一致的條件下(約100μg)進行雙向電泳實驗,得到電泳圖譜如圖1所示。通過分析比較可以看出,每張雙向電泳圖譜上可獲得40～60個可分辨的蛋白斑點,且主要蛋白斑點在凝膠上的分布狀況大體一致。在相對低分子質(zhì)量區(qū)域的偏堿性范圍內(nèi),都出現(xiàn)了若干分布較為集中的蛋白斑點,而在低分子質(zhì)量區(qū)域的偏酸性區(qū)域,分布的蛋白斑點則少得多,說明大部分分子質(zhì)量較小的微生物胞外酶以堿性蛋白質(zhì)為主。在凝膠的高分子質(zhì)量區(qū)域,當以pH值為4.2的乙酸-乙酸鈉浸提緩沖液制備樣品時,可分辨的蛋白斑點相對較少;而當緩沖液為pH值為4.4和pH值為5.0時,有更多的蛋白斑點被分離出來,說明浸提緩沖液pH值的不同會影響所制備樣品的組成。總體說來,當麥曲的浸提緩沖液pH值為5.0時,由雙向電泳分離出來的蛋白斑點最多;就分辨率而言,3種pH條件下的分離效果相差不大。2.3上樣量對視網(wǎng)膜蛋白斑馬魚斑的影響蛋白質(zhì)上樣量的多少也直接影響雙向電泳圖譜的分辨率。圖2表示的是用pH值為5.0的浸提緩沖液制備樣品后,進行不同上樣量的雙向電泳圖譜?？梢钥吹?當上樣量為56μg時,圖譜上肉眼可見的蛋白斑點非常少,低豐度蛋白質(zhì)無法顯示,且蛋白斑點模糊不清,表明此時上樣量偏低(圖2a);而當上樣量為142μg時,部分蛋白斑點出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象,表明此時上樣量偏高(圖2b)。當上樣量為100μg左右時,蛋白斑點不僅較多,而且雙向電泳圖譜的分離分辨率較高,蛋白斑點清晰(圖1c),表明此時上樣量較為合適。3雙向電泳圖譜的制備雙向電泳技術是宏蛋白質(zhì)組學的關鍵技術之一。應用雙向電泳技術對黃酒麥曲中各種微生物胞外酶的可溶性宏蛋白質(zhì)組進行分離,目前未見任何相關報道。本文通過一系列試驗,對影響雙向電泳結果的關鍵條件進行了研究,初步建立了適合于目標樣品的雙向電泳技術體系。影響雙向電泳結果的因素很多,包括材料的選擇,樣品的制備方法,樣品上樣量,等電聚焦程序,實驗技術的熟練程度,試劑的純度等等。高效的樣品制備方法是雙向電泳成功的關鍵,制備方法若選擇不當,會造成大量鹽離子和其它干擾物質(zhì)殘留,嚴重影響等電聚焦,從而影響雙向電泳的結果。如過高鹽離子濃度可能會導致IEF停止,而多糖類(尤其是帶電荷的多糖)會導致雙向電泳圖譜中出現(xiàn)橫條紋。本研究采用TCA-丙酮法沉淀蛋白質(zhì),可以有效地去除鹽離子、酚、多糖等干擾電泳效果的物質(zhì)。同時,通過增加丙酮清洗的次數(shù),能夠更徹底地去除上述雜質(zhì)。但用TCA-丙酮沉淀法制備樣品,在IEF前必須將樣品充分解聚,并使之完全溶解,以免產(chǎn)生水平條紋。本實驗的研究對象是麥曲微生物群落分泌的所有胞外酶,為防止蛋白水解酶對蛋白質(zhì)的降解作用,在樣品制備過程中加入了蛋白酶復合抑制劑,同時確保樣品制備過程盡量保持在低溫條件下。在黃酒生產(chǎn)過程中,酵母接入發(fā)酵醪后,酒醪的pH值會逐步下降,由開始的pH值5.4左右,最后穩(wěn)定在pH值4.0～4.3之間。本研究分別采用了pH值為4.2、4.4、5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液浸提麥曲用以制備樣品進行雙向電泳實驗。由所得的雙向電泳圖譜可以看出,麥曲中微生物分泌的胞外酶具有各不相同的等電點,但不同制備條件下蛋白斑點在凝膠上的分布情況基本一致;當浸提緩沖液pH值為5.0時,分離得到的蛋白斑點最多。就分離分辨率來看,使用3種不同pH值的樣品制備緩沖液進行雙向電泳實驗,分辨率都較高。等電聚焦時間過短會影響雙向電泳結果的分辨率,時間過長則會引起陰極漂移并丟失堿性蛋白。另外,等電聚焦時間過短或過長都會引起水平拖尾。通過實驗發(fā)現(xiàn),當?shù)赛c聚焦總伏特小時數(shù)設定為7500Vh時,效果較好。樣品上樣量的選擇也是能否獲得高質(zhì)量雙向電泳圖譜的關鍵因素之一,上樣量的大小選擇取決于膠條的長度、pH值范圍以及染色方法等。一般說來,低上樣量有利于分離高豐度蛋白,高上樣量有利于分離低豐度蛋白。但過高的上樣量會造成蛋白質(zhì)聚集或沉淀,引起蛋白斑點